Hepatitis B virus integrations promote EMT via upregulation of PAK3 expression in HepG2.2.15 cells

Résumé technique : Les intégrations du virus de l'hépatite B favorisent la transition épithélio-mésenchymateuse via la régulation positive de l'expression de PAK3 dans les cellules HepG2.2.15

Énoncé du problème
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une cause majeure de mortalité liée au cancer, l'infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB) étant un principal facteur de risque. Bien que l'intégration du VHB dans le génome de l'hôte soit détectée dans 85 à 90 % des cas de CHC associés au VHB, les mécanismes moléculaires spécifiques par lesquels ces intégrations stimulent la carcinogenèse hépatique restent incomplètement compris. Des études antérieures suggèrent que, si de nombreuses intégrations sont des événements « passagers » aléatoires, certains sites d'intégration majeurs (SIM) peuvent cibler des gènes moteurs du cancer. De plus, la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) est cruciale pour la métastase tumorale, et le gène de la protéine kinase 3 activée par P21 (PAK3) a été impliqué dans la promotion de la TEM. Cependant, le lien causal entre des événements d'intégration spécifiques du VHB, la régulation positive de PAK3 et la promotion consécutive de la TEM et de la métastase dans le CHC associé au VHB nécessite d'être élucidé, particulièrement compte tenu de l'absence de modèles in vitro présentant des sites d'intégration détectables cliniquement.

Méthodologie
L'étude a employé une approche multidimensionnelle combinant la bioinformatique, des modèles cellulaires in vitro, des modèles animaux et l'analyse de tissus cliniques :

• Analyse clinique et bioinformatique : Les données d'expression génique de The Cancer Genome Atlas (TCGA) ont été analysées pour évaluer l'expression de PAK3 dans 373 cas de CHC. De plus, 20 paires de tissus tumoraux hépatiques et de tissus adjacents non tumoraux provenant de patients atteints d'hépatite B chronique (HBC)-associée au CHC ont été collectées.
• Modèles cellulaires : L'étude a utilisé des cellules HepG2 (contrôle sans intégration) et des cellules HepG2.2.15 (stablement intégrées avec le VHB). Pour simuler le stress oxydatif induit par des dommages à l'ADN, les cellules HepG2.2.15 ont été traitées avec du peroxyde d'hydrogène (H₂O₂).
• Manipulation génétique : Des vecteurs lentiviraux transportant des ARN courts interférents (shRNA) ont été utilisés pour inhiber l'expression de PAK3 dans les cellules HepG2.2.15.
• Détection et quantification :
  • Détection du site d'intégration : La RT-qPCR et la PCR conventionnelle ont été utilisées pour détecter le site d'intégration spécifique du VHB chrX:111,009,033 (situé au sein du gène PAK3) dans les échantillons cliniques et les lignées cellulaires.
  • Profilage moléculaire : Le Western blot, la RT-qPCR, l'immunofluorescence et l'immunohistochimie (IHC) ont été utilisés pour quantifier PAK3, les marqueurs de la TEM (E-cadhérine, N-cadhérine, vimentine) et l'expression d'ITIH4.
  • Essais fonctionnels : Des essais de cicatrisation (wound healing), de migration en Transwell et d'invasion ont été menés pour évaluer la motilité et l'invasivité cellulaires.
  • Transcriptomique : Le séquençage de l'ARN à haut débit (RNA-seq) a été réalisé sur des cellules avec un knockdown de PAK3 pour identifier les gènes différentiellement exprimés (DEG) et les voies de signalisation.
• Validation in vivo : Des souris chimériques uPA⁺/⁺/SCID⁺/⁺ ont reçu des injections de cellules HepG2 ou HepG2.2.15 pour évaluer l'expression de PAK3 et la formation de tumeurs in vivo.

Résultats clés

1. Surexpression de PAK3 dans le CHC : Les analyses bioinformatiques et cliniques ont confirmé que PAK3 est significativement surexprimé dans les tissus de CHC par rapport aux tissus hépatiques sains. Cette surexpression était corrélée aux caractéristiques clinico-pathologiques, notamment l'âge et le stade tumoral.
2. Détection d'un site d'intégration spécifique : Le site d'intégration chrX:111,009,033, qui s'insère dans le gène PAK3, a été détecté dans les hépatocytes de tous les patients suivis pour un CHC associé à l'HBC. L'abondance de ce site d'intégration était significativement plus élevée dans les tissus tumoraux que dans les tissus sains appariés et présentait une corrélation positive avec les niveaux d'expression de PAK3.
3. PAK3 stimule la TEM dans les cellules intégrées au VHB : Les cellules HepG2.2.15 présentaient des niveaux significativement plus élevés de PAK3 et de marqueurs mésenchymateux (vimentine, N-cadhérine) ainsi que des niveaux plus faibles de l'E-cadhérine par rapport aux cellules HepG2. Le traitement par H₂O₂ a accentué ces effets. Inversement, l'inhibition (knockdown) de PAK3 dans les cellules HepG2.2.15 a inversé ces changements, réduisant les marqueurs mésenchymateux et restaurant les niveaux d'E-cadhérine.
4. Potentiel métastatique accru : Les capacités d'invasion et de migration des cellules HepG2.2.15 étaient significativement plus élevées que celles des cellules HepG2. Ce phénotype accru était positivement corrélé au niveau du site d'intégration chrX:111,009,033 et à l'expression de PAK3, et négativement corrélé à l'E-cadhérine. Le knockdown de PAK3 a significativement réduit ces capacités invasives et migratoires.
5. Signalisation en aval et ITIH4 : L'analyse par RNA-seq des cellules avec knockdown de PAK3 a révélé la sous-régulation de 1 682 gènes et la sur-régulation de 660 gènes. Le gène le plus significativement sous-régulé était ITIH4 (Inter-alpha inhibitor H4), un biomarqueur connu du CHC. L'analyse d'enrichissement des voies a indiqué que le knockdown de PAK3 supprimait les voies de signalisation oncogéniques, spécifiquement les voies JAK-STAT (Janus kinase-signal transducer and activator of transcription) et MAPK (mitogen-activated protein kinase).
6. Réseau de corrélation : L'expression d'ITIH4 s'est avérée être positivement corrélée à la fois à l'expression de PAK3 et au site d'intégration chrX:111,009,033. Le knockdown de PAK3 a significativement réduit l'expression d'ITIH4.

Signification et revendications
Les auteurs affirment que cette étude constitue la première exploration systématique des mécanismes oncogéniques médiés par le site d'intégration spécifique du VHB chrX:111,009,033. L'article postule que l'intégration du VHB à ce site spécifique conduit à la régulation positive de PAK3, ce qui favorise ensuite la TEM et augmente la migration et l'invasion des cellules d'hépatome. Ce processus semble être médié par l'activation des voies de signalisation JAK-STAT et MAPK, entraînant la régulation positive de ITIH4.

L'étude suggère que ce mécanisme peut contribuer à la carcinogenèse hépatique indépendante de la fibrose, car ITIH4 est considéré comme un biomarqueur sérique précoce du CHC, indépendamment de la cirrhose. Les auteurs concluent que le site d'intégration chrX:111,009,033 sert de modèle précieux pour étudier la carcinogenèse hépatique induite par le VHB et que la compréhension de cette voie peut fournir une base théorique pour le développement de marqueurs prédictifs précoces et de stratégies thérapeutiques pour le CHC associé à l'HBC.

Limites reconnues
Les auteurs notent plusieurs limites : l'étude n'a pas inclus de cellules HepG2 traitées par H₂O₂ (ce qui aurait pu offrir une évaluation plus complète des effets induits par les ROS) ; les outils d'édition génomique tels que CRISPR/Cas9 n'ont pas été utilisés pour exciser spécifiquement le site d'intégration afin de prouver définitivement la causalité ; et une validation supplémentaire dans d'autres lignées cellulaires, modèles animaux et cohortes cliniques est nécessaire pour clarifier pleinement les mécanismes oncogéniques par étapes.