Streamlined Production of Recombinant Adeno-Associated Viruses Using Gateway Cloning Technology for Neural Circuit All-Optical Interrogation
यह शोध पत्र एक मॉड्यूलर गेटवे क्लोनिंग प्लेटफॉर्म प्रस्तुत करता है जो पुनर्संयोजक (recombinant) AAV वेक्टर्स के सुव्यवस्थित उत्पादन के लिए है, जो जब AOD-आधारित ULoVE टू-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजित किया जाता है, तो वोल्टेज/कैल्शियम इमेजिंग और ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर दोनों के लिए उच्च स्थानिक-कालिक (spatiotemporal) रिज़ॉल्यूशन के साथ तंत्रिका सर्किटों के सटीक, कोशिका-प्रकार-विशिष्ट ऑप्टिकल इंटरोगेशन को सक्षम बनाता है।
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मस्तिष्क को समझने के लिए, वैज्ञानिकों को यह देखने में सक्षम होना चाहिए कि इसकी कोशिकाएं कैसे सोचती हैं और उनके हिलने-डुलने को महसूस करना चाहिए, और वह भी तब जब जानवर जाग रहा हो और अपना जीवन जी रहा हो। दशकों से, यह एक कठिन संतुलन बनाने जैसा रहा है। शोधकर्ताओं ने ऐसे उपकरण विकसित किए हैं जो छोटे, चमकते स्विच और सेंसर की तरह कार्य करते हैं, जिन्हें मस्तिष्क की विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के भीतर चालू किया जा सकता है। ये उपकरण वैज्ञानिकों को विद्युत संकेतों या रासायनिक परिवर्तनों को होते हुए देखने की अनुमति देते हैं। हालाँकि, इन उपकरणों को अच्छी तरह से काम करने के लिए एक सटीक वितरण प्रणाली की आवश्यकता होती है। यदि बहुत अधिक कोशिकाएं चमक उठती हैं, तो दृश्य चमकते पड़ोसियों के कारण धुंधला सा हो जाता है। यदि बहुत कम कोशिकाएं चमकती हैं, तो देखने के लिए कुछ भी नहीं बचता। इसके अलावा, मस्तिष्क के विद्युत संकेत पलक झपकते ही होते हैं, इसलिए उन्हें देखने के लिए उपयोग किए जाने वाले कैमरों को अविश्वसनीय रूप से तेज़ होना चाहिए। चुनौती एक ऐसी वितरण प्रणाली बनाने की थी जो विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए उपकरणों को अनुकूलित करने के लिए पर्याप्त लचीली हो और विचार की गति के साथ तालमेल बिठाने के लिए पर्याप्त तेज़ हो।
पेरिस की एक शोध टीम ने जेनेटिक पैकेज बनाने के एक नए, मॉड्यूलर तरीके का उपयोग करके इस समस्या को हल कर लिया है जो इन उपकरणों को वितरित करते हैं। उन्होंने 'गेटवे क्लोनिंग' नामक एक विधि का उपयोग किया, जो डीएनए के लिए एक हाई-टेक लेगो सेट की तरह काम करती है। हर बार जब वे एक नए सेंसर या मस्तिष्क कोशिका के अलग प्रकार का परीक्षण करना चाहते थे, तो एक नया, जटिल जेनेटिक पैकेज शून्य से बनाने के बजाय, उन्होंने पहले से बने हिस्सों की एक लाइब्रेरी बनाई। वे एक विशिष्ट 'प्रमोटर' (जो केवल एक प्रकार की कोशिका में जीन को चालू करने के लिए एक स्विच के रूप में कार्य करता है) को एक विशिष्ट सेंसर (जो कोशिका के सक्रिय होने पर चमकता है) के साथ जोड़ सकते थे। यह प्रक्रिया तेज़ और विश्वसनीय है, जिससे वे किसी भी प्रयोग के लिए सही वायरल वाहन बनाने हेतु घटकों को आपस में मिला और जोड़ सकते हैं। अपने इस लचीले वितरण तंत्र को एक विशेष माइक्रोस्कोप के साथ जोड़कर, जो प्रति सेकंड हजारों फ्रेम की दर से मस्तिष्क के ऊतकों को स्कैन कर सकता है, वे जीवित चूहों में व्यक्तिगत मस्तिष्क कोशिकाओं की विद्युत गतिविधि को उस स्पष्टता के साथ देखने में सक्षम हुए जो पहले असंभव थी।
शोधकर्ताओं ने अपना ध्यान सेरिबेलम (cerebellum) पर केंद्रित किया, जो खोपड़ी के पीछे मस्तिष्क का एक हिस्सा है जो गति के समन्वय में मदद करता है। वे 'पुरकिंजे सेल' (Purkinje cell) नामक एक विशिष्ट प्रकार की कोशिका की लंबी, शाखाओं वाली भुजाओं के भीतर क्या होता है, यह देखना चाहते थे। ये कोशिकाएं मस्तिष्क के अन्य हिस्सों से भारी मात्रा में सूचना प्राप्त करती हैं, और यह समझना कि वे इस जानकारी को कैसे संसाधित करती हैं, यह समझना महत्वपूर्ण है कि मस्तिष्क गति को कैसे नियंत्रित करता है। अपने नए मॉड्यूलर सिस्टम का उपयोग करते हुए, टीम ने ऐसे वायरस बनाए जो विशेष रूप से इन पुरकिंजे कोशिकाओं में सेंसर ले जाते थे। उन्होंने इंजेक्ट किए गए वायरस की मात्रा को सावधानीपूर्वक समायोजित किया ताकि क्षेत्र की केवल कुछ ही कोशिकाएं चमक उठें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि प्रत्येक चमकती हुई कोशिका अंधेरे बैकग्राउंड के विरुद्ध स्पष्ट रूप से देखी जा सके। फिर उन्होंने एक ऐसे माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जो ध्वनि तरंगों का उपयोग करके लेजर बीम को निर्देशित करता है, जिससे यह मस्तिष्क के विभिन्न बिंदुओं के बीच प्रति सेकंड हजारों बार कूद सकता है। यह गति आवश्यक है क्योंकि जिस विद्युत संकेतों को वे खोज रहे थे, वे एक हजारवें सेकंड से भी कम समय में होते हैं।
जब उन्होंने कोशिकाओं को देखा, तो उन्होंने कुछ उल्लेखनीय देखा। सेंसरों ने उन्हें पुरकिंजे कोशिकाओं की शाखाओं के साथ यात्रा करने वाले सूक्ष्म, तीव्र विद्युत स्पाइक्स (electrical spikes) को देखने की अनुमति दी। अतीत में, इन संकेतों को देखने के लिए कोशिका के भीतर सीधे सुई डालना पड़ता था, जो एक धीमी और आक्रामक प्रक्रिया है जिसे केवल एनेस्थीसिया देकर सुसुप्त किए गए जानवरों पर ही किया जा सकता है। अपने नए ऑप्टिकल उपकरणों का उपयोग करके, टीम ने चूहों में इन संकेतों को देखा जो जाग रहे थे और स्वतंत्र रूप से घूम रहे थे। उन्होंने पाया कि विद्युत संकेत उन रासायनिक संकेतों की तुलना में बहुत तेज़ी से चलते हैं जो उनके पीछे आते हैं। उन्होंने यह भी खोजा कि ये विद्युत स्पाइक्स अक्सर जोड़े या तिहरे रूप में आते हैं, जो एक ऐसी लय के साथ तेजी से होते हैं जो यह सुझाव देती है कि मस्तिष्क कोशिकाएं एक विशिष्ट आवृत्ति पर कंपन कर रही हैं। यह लयबद्ध पैटर्न पहले मृत ऊतकों या एनेस्थीसिया के प्रभाव में देखा गया था, लेकिन एक जीवित, व्यवहार करने वाले जानवर में इसे देखना इस बात की पुष्टि करता है कि यह तीव्र फायरिंग मस्तिष्क के काम करने का एक स्वाभाविक हिस्सा है।
टीम ने अपने सिस्टम का परीक्षण एक अलग प्रकार की कोशिका, 'इंटरन्यूरॉन्स' (interneurons) पर भी किया, जो मस्तिष्क के ब्रेक के रूप में कार्य करते हैं और अन्य कोशिकाओं को सक्रिय होने से रोकते हैं। उन्होंने एक ऐसा वायरस बनाया जिसने इन कोशिकाओं को प्रकाश के प्रति संवेदनशील बना दिया। उसी तेज़-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए, उन्होंने एक एकल इंटरन्यूरॉन को चालू करने के लिए उस पर प्रकाश की एक आकारित बीम डाली। चूंकि बीम बहुत सटीक थी, इसलिए वे अपने पड़ोसियों को छुए बिना केवल एक कोशिका को सक्रिय कर सके। फिर उन्होंने यह देखने के लिए निगरानी की कि क्या यह एकल कोशिका पास के पुरकिंजे सेल को सक्रिय होने से रोक सकती है। उन्होंने पाया कि यह कर सकती है, लेकिन केवल एक बहुत ही विशिष्ट तरीके से। जिन नौ कोशिकाओं का उन्होंने परीक्षण किया, उनमें से केवल एक ही उस पुरकिंजे सेल से जुड़ी थी जिसे वे देख रहे थे। इससे पता चला कि इन कोशिकाओं के बीच के संबंध विरल और अत्यधिक विशिष्ट हैं, जैसे कि एक भीड़भाड़ वाले ब्रॉडकास्ट नेटवर्क के बजाय कुछ समर्पित टेलीफोन लाइनें।
यह कार्य प्रदर्शित करता है कि मस्तिष्क अनुसंधान का भविष्य उपकरणों को तेज़ी से और सटीकता से अनुकूलित करने की क्षमता में निहित है। शोधकर्ताओं ने दिखाया कि जेनेटिक उपकरणों को मॉड्यूलर घटकों के रूप में मानकर, वे विभिन्न प्रश्नों का उत्तर देने के लिए अपनी विधियों को तेज़ी से अनुकूलित कर सकते हैं। उन्होंने सिद्ध किया कि जानवर को नुकसान पहुँचाए बिना या उसके प्राकृतिक व्यवहार को धीमा किए बिना मस्तिष्क में सबसे तेज़ विद्युत घटनाओं को देखना संभव है। यह अध्ययन मस्तिष्क के सभी रहस्यों को सुलझाने का दावा नहीं करता है, लेकिन यह इसे देखने का एक शक्तिशाली नया तरीका प्रदान करता है। जेनेटिक उपकरणों को मॉड्यूलर घटकों के रूप में बनाकर और दृश्य को अधिक स्पष्ट करके, यह दृष्टिकोण यह समझने का द्वार खोलता है कि मस्तिष्क के जटिल सर्किट वास्तविक समय में कैसे कार्य करते हैं, जो हमारी गतिविधियों और विचारों के पीछे की मशीनरी की एक स्पष्ट तस्वीर पेश करता है।
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