Streamlined Production of Recombinant Adeno-Associated Viruses Using Gateway Cloning Technology for Neural Circuit All-Optical Interrogation
Questo articolo presenta una piattaforma di clonaggio Gateway modulare per la produzione snella di vettori AAV ricombinanti che, se combinata con la microscopia a due fotoni ULoVE basata su AOD, consente un'interrogazione ottica precisa e cellula-specifica dei circuiti neurali con alta risoluzione spazio-temporale sia per l'imaging di voltaggio/calcio che per la manipolazione optogenetica.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
Per comprendere il cervello, gli scienziati devono essere in grado di osservare le sue cellule mentre pensano e sentirle muoversi, il tutto mentre l'animale è sveglio e vive la sua vita. Per decenni, questo è stato un difficile gioco di equilibrio. I ricercatori hanno sviluppato strumenti che agiscono come minuscoli interruttori luminosi e sensori, che possono essere accesi all'interno di tipi specifici di cellule cerebrali. Questi strumenti permettono agli scienziati di vedere i segnali elettrici o i cambiamenti chimici mentre accadono. Tuttavia, far sì che questi strumenti funzionino bene richiede un sistema di consegna preciso. Se troppe cellule si illuminano, la visione diventa un groviglio confuso di vicini luminosi. Se se ne illuminano troppo poche, non c'è nulla da vedere. Inoltre, i segnali elettrici del cervello avvengono in un battito di ciglia, quindi le telecamere utilizzate per osservarli devono essere incredibilmente veloci. La sfida è stata costruire un sistema di consegna che fosse abbastanza flessibile da personalizzare gli strumenti per diverse regioni cerebrali e abbastanza veloce da stare al passo con la velocità del pensiero.
Un team di ricercatori a Parigi ha risolto questo problema creando un nuovo modo modulare per costruire i pacchetti genetici che consegnano questi strumenti. Hanno utilizzato un metodo chiamato clonazione Gateway, che funziona come un set Lego ad alta tecnologia per il DNA. Invece di costruire un nuovo e complesso pacchetto genetico da zero ogni volta che volevano testare un nuovo sensore o un diverso tipo di cellula cerebrale, hanno creato una libreria di parti pre-assemblate. Potevano incastrare insieme un promotore specifico, che agisce come un interruttore per attivare un gene solo in un tipo di cellula, con un sensore specifico, ovvero la parte che brilla quando la cellzione si attiva. Questo processo è veloce e affidabile, consentendo loro di mescolare e abbinare i componenti per creare il veicolo virale perfetto per qualsiasi esperimento. Combinando questo sistema di consegna flessibile con un microscopio specializzato in grado di scansionare il tessuto cerebrale a migliaia di fotogrammi al secondo, sono stati in grado di osservare l'attività elettrica di singole cellule cerebrali in topi vivi con una chiarezza precedentemente impossibile.
I ricercatori hanno concentrato il loro lavoro sul cervelletto, una parte del cervello situata nella parte posteriore del cranio che aiuta a coordinare il movimento. Volevano vedere cosa accade all'interno delle lunghe braccia ramificate di un tipo specifico di cellula chiamata cellula di Purkinje. Queste cellule ricevono enormi quantità di informazioni da altre parti del cervello, e comprendere come elaborano queste informazioni è fondamentale per capire come il cervello controlli il movimento. Utilizzando il loro nuovo sistema modulare, il team ha costruito virus che trasportavano sensori specificamente nelle cellule di Purkinje. Hanno regolato attentamente la quantità di virus iniettato in modo che solo poche cellule nell'area si illuminassero, garantendo che ogni cellula luminosa potesse essere vista chiaramente contro lo sfondo scuro. Hanno poi utilizzato un microscopio che usa onde sonore per guidare un raggio laser, permettendogli di saltare tra diversi punti del cervello migliaia di volte al secondo. Questa velocità è essenziale perché i segnali elettrici che stavano cercando avvengono in meno di un millesimo di secondo.
Quando hanno osservato le cellule, hanno visto qualcosa di straordinario. I sensori hanno permesso loro di vedere i minuscoli e rapidi picchi elettrici che viaggiano lungo le ramificazioni delle cellule di Purkinje. In passato, vedere questi segnali richiedeva l'inserimento di un ago direttamente nella cellula, una procedura lenta e invasiva che può essere eseguita solo su animali anestetizzati. Utilizzando i loro nuovi strumenti ottici, il team ha osservato questi segnali in topi svegli e in movimento libero. Hanno scoperto che i segnali elettrici viaggiavano molto più velocemente dei segnali chimici che li seguono. Hanno anche scoperto che questi picchi elettrici spesso arrivano in coppie o triplette, accadendo in rapida successione con un ritmo che suggerisce che le cellule cerebrali stiano vibrando a una frequenza specifica. Questo schema ritmico era già stato visto in precedenza in tessuti morti o sotto anestesia, ma vederlo in un animale vivo e in comportamento ha confermato che questo rapido firing è una parte naturale di come il cervello funziona.
Il team ha anche testato il loro sistema su un altro tipo di cellula, gli interneuroni, che agiscono come i freni del cervello bloccando l'attivazione di altre cellule. Hanno costruito un virus che rendeva queste cellule sensibili alla luce. Utilizzando lo stesso microscopio a scansione rapida, hanno proiettato un fascio di luce sagomato su un singolo interneurone per attivarlo. Poiché il fascio era così preciso, potevano attivare una sola cellula senza toccare le sue vicine. Hanno poi osservato per vedere se questa singola cellula potesse bloccare l'attivazione di una cellula di Purkinje vicina. Hanno scoperto che poteva farlo, ma solo in un modo molto specifico. Su nove cellule testate, solo una era connessa alla cellula di Purkinje che stavano osservando. Ciò ha dimostrato che le connessioni tra queste cellule sono scarse e altamente specifiche, come pochi fili telefonici dedicati piuttosto che una rete di trasmissione affollata.
Questo lavoro dimostra che il futuro della ricerca sul cervello risiede nella capacità di personalizzare strumenti in modo rapido e preciso. I ricercatori hanno dimostrato che, trattando gli strumenti genetici come componenti modulari, potevano adattare rapidamente i loro metodi per rispondere a diverse domande. Hanno provato che è possibile vedere gli eventi elettrici più veloci nel cervello senza danneggiare l'animale o rallentare il suo comportamento naturale. Lo studio non sostiene di aver risolto tutti i misteri del cervello, ma fornisce un nuovo e potente modo per guardarlo. Rendendo gli strumenti più facili da costruire e la visione più chiara, questo approccio apre la porta alla comprensione di come i complessi circuiti cerebrali funzionano in tempo reale, offrendo un quadro più nitido del meccanismo che sta dietro ai nostri movimenti e ai nostri pensieri.
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