Streamlined Production of Recombinant Adeno-Associated Viruses Using Gateway Cloning Technology for Neural Circuit All-Optical Interrogation
Dit artikel presenteert een modulair Gateway-kloningsplatform voor de gestroomlijnde productie van recombinante AAV-vectoren die, wanneer gecombineerd met AOD-gebaseerde ULoVE twee-foton microscopie, precieze, celtype-specifieke optische interrogatie van neurale circuits mogelijk maakt met een hoge spatiotemporele resolutie voor zowel voltage-/calciumimaging als optogenetische manipulatie.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
Om de hersenen te begrijpen, moeten wetenschappers in staat zijn om de cellen te zien denken en de bewegingen ervan te voelen, terwijl het dier wakker is en zijn leven leidt. Decennialang was dit een moeilijk evenwichtsoefening. Onderzoekers hebben hulpmiddelen ontwikkeld die werken als kleine, lichtgevende schakelaars en sensoren, die binnen specifieke typen hersencellen kunnen worden ingeschakeld. Deze hulpmiddelen stellen wetenschappers in staat om elektrische signalen of chemische veranderingen te zien terwijl ze plaatsvinden. Het vereist echter een nauwkeurig leveringssysteem om deze hulpmiddelen goed te laten werken. Als er te veel cellen oplichten, wordt het zicht een wazige bende van gloeiende buren. Als er te weinig oplichten, is er niets te zien. Bovendien vinden de elektrische signalen in de hersenen plaats in de oogwenk, dus de camera's die gebruikt worden om ze te observeren, moeten ongelooflijk snel zijn. De uitdaging was om een leveringssysteem te bouwen dat flexibel genoeg is om de hulpmiddelen aan te passen aan verschillende hersengebieden en snel genoeg om het tempo van het denken bij te houden.
Een team onderzoekers in Parijs heeft dit probleem opgelost door een nieuwe, modulaire manier te creëren om de genetische pakketjes te bouwen die deze hulpmiddelen leveren. Ze gebruikten een methode genaamd Gateway-clonering, die werkt als een hoogwaardige Lego-set voor DNA. In plaats van elke keer een nieuw, complex genetisch pakketje vanaf nul op te bouwen wanneer ze een nieuwe sensor of een ander type hersencel wilden testen, creëerden ze een bibliotheek van vooraf gemaakte onderdelen. Ze konden een specifieke promotor, die fungeert als een schakelaar om een gen in slechts één type cel aan te zetten, samenvoegen met een specifieke sensor, het onderdeel dat gloeit wanneer de cel vuurt. Dit proces is snel en betrouwbaar, waardoor ze componenten kunnen mixen en matchen om het perfecte virale voertuig voor elk experiment te creëren. Door dit flexibele leveringssysteem te combineren met een gespecialiseerde microscoop die hersenweefsel kan scannen met duizenden frames per seconde, waren ze in staat om de elektrische activiteit van individuele hersencellen in levende muizen te observeren met een helderheid die voorheen onmogelijk was.
De onderzoekers richtten hun werk op het cerebellum, een deel van de hersenen aan de achterkant van de schedel dat helpt bij het coördineren van beweging. Ze wilden zien wat er gebeurt in de lange, vertakte armen van een specifiek type cel genaamd een Purkinje-cel. Deze cellen ontvangen enorme hoeveelheden informatie van andere delen van de hersenen, en het begrijpen van hoe ze deze informatie verwerken, is essentieel voor het begrijpen van hoe de hersenen beweging aansturen. Met hun nieuwe modulaire systeem bouwden het team virussen die de sensoren specifiek naar deze Purkinje-cellen brachten. Ze pasten de hoeveelheid geïnjecteerd virus zorgvuldig aan, zodat slechts een paar cellen in het gebied zouden oplichten, wat ervoor zorgde dat elke gloeiende cel duidelijk zichtbaar was tegen de donkere achtergrond. Vervolgens gebruikten ze een microscoop die geluidsgolven gebruikt om een laserstraal te sturen, waardoor deze duizenden keren per seconde tussen verschillende punten in de hersenen kan springen. Deze snelheid is essentieel omdat de elektrische signalen waar ze naar op zoek waren, minder dan een duizendste van een seconde duren.
Toen ze de cellen observeerden, zagen ze iets opmerkelijks. De sensoren stelden hen in staat om de kleine, snelle elektrische pieken te zien die langs de vertakkingen van de Purkinje-cellen reizen. In het verleden vereiste het zien van deze signalen het inbrengen van een naald direct in de cel, wat een langzaam en invasief proces is dat alleen kan worden uitgevoerd bij geanestheseerde dieren. Door hun nieuwe optische hulpmiddelen te gebruiken, observeerde het team deze signalen in muizen die wakker waren en vrij bewogen. Ze ontdekten dat de elektrische signalen veel sneller reisden dan de chemische signalen die erachter volgen. Ze ontdekten ook dat deze elektrische pieken vaak in paren of trios voorkomen, waarbij ze in snelle opeenvolging optreden met een ritme dat suggereert dat de hersencellen op een specifieke frequentie trillen. Dit ritmische patroon was eerder waargenomen in dood weefsel of onder anesthesie, maar het zien van dit in een levend, gedragend dier bevestigde dat dit snelle vuren een natuurlijk onderdeel is van hoe de hersenen werken.
Het team testte hun systeem ook op een ander type cel, de interneuronen, die fungeren als de remmen van de hersenen door andere cellen te stoppen met vuren. Ze bouwden een virus dat deze cellen gevoelig maakte voor licht. Met behulp van dezelfde snelle scannende microscoop schijnen ze een gevormde lichtstraal op een enkele interneuron om deze aan te zetten. Omdat de straal zo precies was, konden ze slechts één cel activeren zonder de naburige cellen te raken. Ze observeerden vervolgens of deze enkele cel een nabijgelegen Purkinje-cel kon stoppen met vuren. Ze ontdekten dat dit kon, maar alleen op een zeer specifieke manier. Van de negen cellen die ze testten, was er slechts één verbonden met de Purkinje-cel die ze volgden. Dit toonde aan dat de verbindingen tussen deze cellen schaars en zeer specifiek zijn, zoals een paar toegewijde telefoonlijnen in plaats van een druk breedzend netwerk.
Dit werk toont aan dat de toekomst van hersenonderzoek ligt in het vermogen om hulpmiddelen snel en precies aan te passen. De onderzoekers lieten zien dat door genetische hulpmiddelen als modulaire componenten te behandelen, ze hun methoden snel konden aanpassen om verschillende vragen te beantwoorden. Ze bewezen dat het mogelijk is om de snelste elektrische gebeurtenissen in de hersenen te zien zonder het dier te beschadigen of het natuurlijke gedrag te vertragen. De studie beweert niet alle mysteries van de hersenen te hebben opgelost, maar biedt een krachtige nieuwe manier om ernaar te kijken. Door de hulpmiddelen gemakkelijker te maken om te bouwen en het zicht helderder te maken, opent deze aanpak de deur naar het begrijpen van hoe de complexe circuits van de hersenen in realtime functioneren, wat een duidelijker beeld geeft van de machinerie achter onze bewegingen en gedachten.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.