Streamlined Production of Recombinant Adeno-Associated Viruses Using Gateway Cloning Technology for Neural Circuit All-Optical Interrogation
Cet article présente une plateforme de clonage Gateway modulaire pour la production rationalisée de vecteurs AAV recombinants qui, lorsqu'elle est combinée à la microscopie à deux photons ULoVE basée sur l'AOD, permet une interrogation optique précise et spécifique aux types cellulaires des circuits neuronaux avec une haute résolution spatio-temporelle pour l'imagerie de tension/calcium ainsi que pour la manipulation optogénétique.
Article original sous licence CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Ceci est une explication générée par l'IA d'un preprint qui n'a pas été évalué par des pairs. Ce n'est pas un avis médical. Ne prenez pas de décisions de santé basées sur ce contenu. Lire la clause de non-responsabilité complète
Pour comprendre le cerveau, les scientifiques doivent être capables de regarder ses cellules penser et de ressentir leur mouvement, tout en l'animal est éveillé et vit sa vie. Pendant des décennies, cela a été un équilibre difficile à maintenir. Les chercheurs ont développé des outils qui agissent comme de minuscules interrupteurs et capteurs lumineux, qui peuvent être activés à l'intérieur de types spécifiques de cellules cérébrales. Ces outils permettent aux scientifiques de voir les signaux électriques ou les changements chimiques au moment où ils se produisent. Cependant, faire en sorte que ces outils fonctionnent bien nécessite un système de livraison précis. Si trop de cellules s'illuminent, la vue devient un fouillis flou de voisins brillants. Si trop peu s'illuminent, il n'y a rien à voir. De plus, les signaux électriques du cerveau se produisent en un clin d'œil, de sorte que les caméras utilisées pour les observer doivent être incroyablement rapides. Le défi a été de construire un système de livraison suffisamment flexible pour personnaliser les outils selon les différentes régions du cerveau et assez rapide pour suivre la vitesse de la pensée.
Une équipe de chercheurs à Paris a résolu ce problème en créant une nouvelle façon modulaire de construire les paquets génétiques qui livrent ces outils. Ils ont utilisé une méthode appelée clonage Gateway, qui fonctionne comme un ensemble de Lego de haute technologie pour l'ADN. Au lieu de construire un nouveau paquet génétique complexe à chaque fois qu'ils voulaient tester un nouveau capteur ou un type de cellule cérébrale différent, ils ont créé une bibliothèque de pièces préfabriquées. Ils pouvaient assembler un promoteur spécifique, qui agit comme un interrupteur pour activer un gène dans un seul type de cellule, avec un capteur spécifique, qui est la partie qui brille lorsque la cellule s'active. Ce processus est rapide et fiable, permettant de mélanger et d'associer les composants pour créer le véhicule viral parfait pour toute expérience. En combinant ce système de livraison flexible avec un microscope spécialisé capable de scanner le tissu cérébral à des milliers d'images par seconde, ils ont pu observer l'activité électrique de cellules cérébrales individuelles chez des souris vivantes avec une clarté auparavant impossible.
Les chercheurs ont concentré leurs travaux sur le cervelet, une partie du cerveau située à l'arrière du crâne qui aide à coordonner le mouvement. Ils voulaient voir ce qui se passe à l'intérieur des longs bras ramifiés d'un type de cellule spécifique appelé cellule de Purkinje. Ces cellules reçoivent des quantités massives d'informations provenant d'autres parties du cerveau, et comprendre comment elles traitent cette information est essentiel pour comprendre comment le cerveau contrôle le mouvement. En utilisant leur nouveau système modulaire, l'équipe a construit des virus transportant des capteurs spécifiquement dans ces cellules de Purkinje. Ils ont soigneusement ajusté la quantité de virus injecté pour que seules quelques cellules de la zone s'illuminent, garantissant que chaque cellule brillante puisse être vue clairement sur le fond sombre. Ils ont ensuite utilisé un microscope qui utilise des ondes sonores pour diriger un faisceau laser, lui permettant de sauter entre différents points du cerveau des milliers de fois par seconde. Cette vitesse est essentielle car les signaux électriques qu'ils recherchaient se produisent en moins d'un millième de seconde.
Lorsqu'ils ont observé les cellules, ils ont vu quelque chose de remarquable. Les capteurs leur ont permis de voir les minuscules et rapides pics électriques qui voyagent le long des branches des cellules de Purkinje. Par le passé, observer ces signaux nécessitait l'insertion d'une aiguille directement dans la cellule, une procédure lente et invasive qui ne peut être réalisée que sur des animaux anesthésiés. En utilisant leurs nouveaux outils optiques, l'équipe a observé ces signaux chez des souris éveillées et se déplaçant librement. Ils ont découvert que les signaux électriques voyageaient beaucoup plus vite que les signaux chimiques qui les suivent. Ils ont également découvert que ces pics électriques arrivaient souvent par paires ou par triplets, se produisant en succession rapide avec un rythme suggérant que les cellules cérébrales vibraient à une fréquence spécifique. Ce motif rythmique avait déjà été observé dans des tissus morts ou sous anesthésie, mais le voir dans un animal vivant et actif a confirmé que ce tir rapide est une partie naturelle du fonctionnement du cerveau.
L'équipe a également testé son système sur un autre type de cellule, les interneurones, qui agissent comme les freins du cerveau en empêchant d'autres cellules de s'activer. Ils ont construit un virus qui rend ces cellules sensibles à la lumière. En utilisant le même microscope à balayage rapide, ils ont projeté un faisceau de lumière profilé sur un seul interneurone pour l'activer. Grâce à la précision du faisceau, ils ont pu activer une seule cellule sans toucher à ses voisines. Ils ont ensuite observé si cette cellule unique pouvait empêcher une cellule de Purkinje voisine de s'activer. Ils ont découvert que c'était possible, mais d'une manière très spécifique. Sur neuf cellules testées, une seule était connectée à la cellule de Purkinje qu'ils observaient. Cela a montré que les connexions entre ces cellules sont éparses et hautement spécifiques, comme quelques lignes téléphoniques dédiées plutôt qu'un réseau de diffusion bondé.
Ce travail démontre que l'avenir de la recherche sur le cerveau réside dans la capacité à personnaliser les outils rapidement et précisément. Les chercheurs ont montré qu'en traitant les outils génétiques comme des composants modulaires, ils pouvaient adapter rapidement leurs méthodes pour répondre à différentes questions. Ils ont prouvé qu'il est possible d'observer les événements électriques les plus rapides du cerveau sans nuire à l'animal ni ralentir son comportement naturel. L'étude ne prétend pas avoir résolu tous les mystères du cerveau, mais elle offre une nouvelle et puissante façon de l'observer. En rendant les outils plus faciles à construire et la vue plus claire, cette approche ouvre la porte à la compréhension du fonctionnement des circuits complexes du cerveau en temps réel, offrant une image plus nette de la machinerie qui sous-tend nos mouvements et nos pensées.
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