A Third-generation Lentiviral Vector System for Flow Virometry-based Analysis of HIV-1 Env and Other Viral Envelope Proteins

वायरस एक समान मशीनें नहीं हैं; वे व्यक्तिगत कणों का एक झुंड हैं जो अलग-अलग दिख सकते हैं और व्यवहार कर सकते हैं, भले ही वे बिल्कुल एक ही जेनेटिक कोड (आनुवंशिक कोड) ले जा रहे हों। यह छिपी हुई विविधता, जिसे गैर-जेनेटिक विविधता (non-genetic diversity) के रूप में जाना जाता है, इसलिए होती है क्योंकि कोशिका के भीतर का वातावरण इस बात को आकार देता है कि एक वायरस कैसे बनाया जाता है। ह्यूमन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस, या एचआईवी (HIV) के लिए, यह भिन्नता एक बड़ी बाधा है। भले ही वैज्ञानिक वायरस को लॉक करने और कोशिकाओं को संक्रमित करने से रोकने के लिए शक्तिशाली एंटीबॉडी डिजाइन करें, वायरस के झुंड का एक छोटा सा हिस्सा अक्सर बच निकलता है। ये निरंतर बने रहने वाले कण एंटीबॉडी की उपस्थिति के बावजूद संक्रामक बने रहते हैं, जिससे संभावित रूप से वायरस को छिपने और जीवित रहने में मदद मिलती है। कुछ कण क्यों बच जाते हैं जबकि अन्य पकड़े जाते हैं, इसे समझने के लिए, शोधकर्ताओं को पूरे समूह को एक एकल द्रव्यमान के रूप में अध्ययन करने के बजाय, व्यक्तिगत वायरसों को एक-एक करके देखने की आवश्यकता है।

इसे करने में चुनौती यह है कि वायरस अविश्वसनीय रूप से छोटे होते हैं, जो अक्सर मानक सूक्ष्मदर्शी (microscopes) द्वारा स्पष्ट रूप से देखे जाने के लिए बहुत छोटे होते हैं या तरल नमूनों में तैरते धूल और मलबे से अलग पहचाने जाने के लिए बहुत सूक्ष्म होते हैं। हालांकि वैज्ञानिकों ने इन छोटे कणों को गिनने के लिए उपकरण विकसित किए हैं, लेकिन पिछले तरीकों के लिए अक्सर वायरस के खतरनाक, पूरी तरह से संक्रामक संस्करणों का उपयोग करना आवश्यक था, जो यह सीमित करता है कि कौन और कहाँ इसका अध्ययन कर सकता है। अन्य विधियों ने वायरसों को बड़े मोतियों (beads) से जोड़ने या उन रंगों (dyes) पर भरोसा किया जो सब कुछ रंग देते हैं, जिससे एक वास्तविक वायरस और कोशिकीय कचरे के टुकड़े के बीच अंतर करना कठिन हो जाता है। इसे हल करने के लिए, जर्मनी में शोधकर्ताओं की एक टीम ने एक नया, सुरक्षित उपकरण बनाया है जो उन्हें बिना किसी खतरनाक संक्रमण के जोखिम के, व्यक्तिगत वायरल कणों को तैरते हुए, चमकते हुए और एंटीबॉडी के साथ क्रिया करते हुए देखने की अनुमति देता है।

शोधकर्ताओं ने तीसरे संस्करण के लेंटिविरल वेक्टर सिस्टम (third-generation lentiviral vector system) से शुरुआत की, जो एक प्रकार का वायरस-आधारित डिलीवरी टूल है जो पहले से ही अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, लेकिन इसे बहुत सुरक्षित बनाने के लिए संशोधित किया गया है। इस सिस्टम में, वायरस एक कोशिका में प्रवेश कर सकता है और संदेश दे सकता है, लेकिन वह संक्रमण फैलाने के लिए अपनी नई प्रतियां नहीं बना सकता है। इन कणों को दृश्यमान बनाने के लिए, टीम ने सीधे वायरस के अपने संरचनात्मक कवच (shell) में एक चमकते हुए प्रोटीन के जीन को डाला। उन्होंने इस चमकने वाले जीन को वायरस के मुख्य निर्माण खंड के दो विशिष्ट खंडों के बीच रखने का निर्णय लिया, जिसे वायरस द्वारा स्वाभाविक रूप से ले जाए जाने वाले आणविक कैंची (molecular scissors) द्वारा घेरा गया है। जैसे-जैसे वायरस परिपक्व होता है, ये आणविक कैंची चमकने वाले प्रोटीन को मुक्त करती हैं, जिससे वह सीधे कण की दीवार में समा जाता है। इसका मतलब है कि इस नए सिस्टम से बना प्रत्येक वायरस अपनी आंतरिक रोशनी के साथ हरा या लाल चमकता है, बिना किसी बाहरी डाई की आवश्यकता के।

चूंकि वायरस अपने आप प्रजनन नहीं कर सकता, इसलिए इसे मानक प्रयोगशालाओं में संभालना सुरक्षित है। टीम ने इन चमकते कणों का उत्पादन किया और परीक्षण किया कि क्या वे इच्छानुसार काम करते हैं। उन्होंने पाया कि हालांकि चमकते हुए कण गैर-चमकने वाले कणों की तुलना में थोड़ी कम संख्या में उत्पादित हुए थे, फिर भी वे अध्ययन के लिए पर्याप्त मात्रा में बनाए गए थे। महत्वपूर्ण रूप से, कणों ने कोशिकाओं को संक्रमित करने की अपनी क्षमता बरकरार रखी, जिससे यह सिद्ध हुआ कि चमकने वाले जुड़ाव ने वायरस की मशीनरी को नहीं तोड़ा है। यह पुष्टि करने के लिए कि प्रकाश स्वयं वायरस से आ रहा है न कि तैरते हुए यादृच्छिक कणों से, शोधकर्ताओं ने कणों को कोशिकाओं से जुड़े हुए देखने के लिए एक उच्च-शक्ति वाले इमेजिंग कैमरे का उपयोग किया। छवियों ने कोशिका की सतह पर स्थित स्पष्ट, चमकते बिंदुओं को दिखाया, जिससे पुष्टि हुई कि वायरस कण वास्तव में अपनी स्वयं की रोशनी ले जा रहे थे।

एक विश्वसनीय स्रोत वाले चमकते, सुरक्षित कणों के साथ, टीम फिर व्यक्तिगत रूप से उन्हें गिनने के कार्य की ओर बढ़ी। एक विशेष फ्लो साइटोमीटर (flow cytometer) का उपयोग करते हुए, जो एक लेजर से गुजरने वाले कणों को गिनता है और मापता है, उन्हें एचआईवी जैसे छोटे दिखने वाले पिंडों को देखने के लिए सेटिंग्स को ट्यून करना पड़ा, जो लगभग एक सौ नैनोमीटर चौड़े होते हैं। उन्होंने मशीन के डिटेक्टरों की संवेदनशीलता को समायोजित किया और बैकग्राउंड शोर को अनदेखा करने के लिए एक विशिष्ट थ्रेशोल्ड (threshold) निर्धारित किया। ज्ञात आकार के मोतियों और फिर अपने स्वयं के चमकते वायरसों के साथ मशीन का परीक्षण करके, उन्होंने यह निर्धारित किया कि वास्तविक वायरस को उसके आसपास तैरते खाली तरल से अलग करने के लिए सटीक सेटिंग्स क्या होनी चाहिए। उन्होंने पाया कि डिटेक्शन थ्रेशोल्ड को बढ़ाकर, वे लगभग सभी शोर को छान सकते थे, जिससे यह सुनिश्चित हुआ कि जब भी उन्हें एक चमकती घटना दिखाई देती है, तो वह लगभग निश्चित रूप से एक वायरस ही होता है।

यह साबित करने के लिए कि सिस्टम वास्तविक दुनिया के सवालों के लिए तैयार है, शोधकर्ताओं ने इन कणों की सतह पर एंटीबॉडी के जुड़ने का पता लगाने की क्षमता का परीक्षण किया। उन्होंने अपने चमकते वायरस के तीन अलग-अलग संस्करण बनाए, जिनमें से प्रत्येक पर एक अलग वायरल कोट (coat) था। एक पर वेसिकुलर स्टोमेटिस वायरस (vesicular stomatitis virus) का कोट था, दूसरे पर SARS-CoV-2 वायरस का स्पाइक प्रोटीन था, और तीसरे पर HIV का एनवेलप प्रोटीन था। फिर उन्होंने विशिष्ट एंटीबॉडी बनाई जो इन प्रत्येक कोट को पकड़ने के लिए डिज़ाइन की गई थी। एंटीबॉडी को एक अलग रंग से टैग किया गया था ताकि मशीन उन्हें देख सके। जब उन्होंने नमूनों को मशीन के माध्यम से चलाया, तो उन्होंने देखा कि एंटीबॉडी ने चमकते कणों पर सफलतापूर्वक कब्जा कर लिया। वेसिकुलर स्टोमेटिस वायरस कोट के लिए, एंटीबॉडी ने लगभग अस्सी प्रतिशत कणों को पकड़ा। SARS-CoV-2 और HIV कोट्स के लिए, एंटीबॉडी ने लगभग आधे कणों को पकड़ा।

एंटीबॉडी द्वारा हर एक कण को न पकड़ पाना मशीन की विफलता नहीं थी, बल्कि वायरस के बारे में एक रहस्योद्घाटन था। शोधकर्ताओं ने देखा कि कणों में इस बात की भिन्नता थी कि वे कितना कोट प्रोटीन ले जा रहे थे और वह कोट कितना सुलभ था। कुछ कणों में बहुत कम स्पाइक्स हो सकते हैं, या स्पाइक्स इस तरह से मुड़े हुए हो सकते हैं जो एंटीबॉडी के लक्ष्य को छिपा देते हैं। यह भिन्नता आनुवंशिक रूप से समान वायरसों के बीच भी होती है। नए सिस्टम ने टीम को इस विविधता को सीधे देखने की अनुमति दी। वे उन कणों के बीच अंतर कर सके जो पूरी तरह से कोटेड और पकड़े जाने के लिए तैयार थे, और उन कणों के बीच जो आंशिक रूप से कोटेड थे या जिनका लक्ष्य गायब था। उन्होंने यह भी पुष्टि की कि चमकते कण वास्तविक वायरस थे जिनमें एक सुरक्षात्मक बाहरी झिल्ली (membrane) थी, क्योंकि जब उन्होंने नमूने को डिटर्जेंट के साथ उपचारित किया जो झिल्लियों को घोल देता है, तो चमकते कणों की संख्या काफी कम हो गई, जिससे पता चला कि प्रकाश बरकरार, झिल्ली-बद्ध संरचनाओं से आ रहा था।

यह कार्य वायरसों की छिपी हुई विविधता का अध्ययन करने के लिए एक नया प्लेटफॉर्म स्थापित करता है। एक सुरक्षित, गैर-प्रतिकृति (non-replicating) वायरस बैकबोन के साथ अंतर्निहित चमकते मार्करों को जोड़कर, शोधकर्ताओं ने एक ऐसा उपकरण बनाया है जिसका उपयोग व्यक्तिगत वायरल कणों के साथ विभिन्न एंटीबॉडी कैसे परस्पर क्रिया करती हैं, इसका विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण खतरनाक, पूरी तरह से संक्रामक वायरसों की आवश्यकता को समाप्त करता है और गैर-विशिष्ट रंगों के कारण होने वाले भ्रम को दूर करता है। यह सिस्टम वायरल कोट को बदलने के लिए पर्याप्त बहुमुखी है, जिससे वैज्ञानिक एक ही अंतर्निहित कण का उपयोग करके HIV, SARS-CoV-2 या अन्य वायरसों का अध्ययन कर सकते हैं। यह क्षमता यह समझने का द्वार खोलती है कि कुछ वायरस एंटीबॉडी हमलों से क्यों बच निकलते हैं जबकि अन्य क्यों नहीं, जिससे गैर-जेनेटिक अंतरों का एक स्पष्ट दृश्य मिलता है जो वायरल उत्तरजीविता और निरंतरता को संचालित करते हैं।