A Third-generation Lentiviral Vector System for Flow Virometry-based Analysis of HIV-1 Env and Other Viral Envelope Proteins

Viren sind keine einheitlichen Maschinen; sie sind Schwärme einzelner Partikel, die unterschiedlich aussehen und agieren können, selbst wenn sie exakt denselben genetischen Code tragen. Diese verborgene Vielfalt, bekannt als nicht-genetische Diversität, tritt auf, weil die Umgebung innerhalb einer Zelle bestimmt, wie ein Virus aufgebaut wird. Für das Humanimmunodeficiencyvirus, oder HIV, stellt diese Variation eine große Hürde dar. Selbst wenn Wissenschaftler hochwirksame Antikörper entwickeln, um an ein Virus zu binden und dessen Infektion von Zellen zu stoppen, entkommt oft ein kleiner Bruchteil des Virus-Schwarms. Diese hartnäckigen Partikel bleiben trotz der Anwesenheit des Antikörpers infektiös, was es dem Virus ermöglichen kann, sich zu verstecken und zu überleben. Um zu verstehen, warum einige Partikel entkommen, während andere gefangen werden, müssen Forscher die einzelnen Viren eines nach dem anderen untersuchen, anstatt die gesamte Gruppe als eine einzige Masse zu betrachten.

Die Herausforderung bei diesem Vorhaben besteht darin, dass Viren unglaublich klein sind, oft zu winzig, um mit Standardmikroskopen klar gesehen oder von dem Staub und den Trümmern unterschieden werden zu können, die natürlich in Flüssigproben schweben. Während Wissenschaftler Werkzeuge entwickelt haben, um diese winzigen Partikel zu zählen, erforderten frühere Methoden oft die Verwendung gefährlicher, voll infektionsfähiger Versionen des Virus, was den Kreis der Forscher, die dies studieren können, sowie die Orte der Forschung einschränkt. Andere Methoden basierten darauf, Viren an größere Kügelchen (Beads) zu heften oder Farbstoffe zu verwenden, die alles einfärben, was es schwierig macht, ein echtes Virus von einem Stück zellulären Abfalls zu unterscheiden. Um dies zu lösen, hat ein Forscherteam in Deutschland ein neues, sichereres Werkzeug entwickelt, das es ihnen ermöglicht, einzelne Viruspartikel vorbeischweben zu sehen, wie sie aufleuchten und mit Antikörpern interagieren, ohne das Risiko einer gefährlichen Infektion zu erzeugen.

Die Forscher begannen mit einem Lentiviralen Vektor-System der dritten Generation, einer Art virusbasiertem Delivery-Tool, das bereits weit verbreitet in der Forschung eingesetzt wird, aber modifiziert wurde, um wesentlich sicherer zu sein. In diesem System kann das Virus in eine Zelle eindringen und eine Nachricht übermitteln, aber es kann keine neuen Kopien seiner selbst bauen, um die Infektion zu verbreiten. Um diese Partikel sichtbar zu machen, inserierte das Team ein Gen für ein leuchtendes Protein direkt in die eigene Strukturhülle des Virus. Sie entschieden sich dafür, dieses leuchtende Gen zwischen zwei spezifische Abschnitte des Hauptbausteins des Virus zu platzieren, flankiert von molekularen Scheren, die das Virus von Natur aus trägt. Während das Virus reift, schneiden diese molekularen Scheren das leuchtende Protein frei und betten es direkt in die Wand des Partikels ein. Das bedeutet, dass jedes mit diesem neuen System hergestellte Virus mit seinem eigenen internen Licht leuchtet, entweder grün oder rot, ohne dass ein externer Farbstoff benötigt wird.

Da das Virus nicht aus eigener Kraft replizieren kann, ist es in Standardlaboratorien sicher zu handhaben. Das Team produzierte diese leuchtenden Partikel und testete, ob sie noch wie beabsichtigt funktionierten. Sie fanden heraus, dass die leuchtenden Partikel zwar in etwas geringeren Zahlen als die nicht-leuchtenden produziert wurden, aber dennoch in ausreichender Menge für Studien vorhanden waren. Entscheidend war, dass die Partikel weiterhin die Fähigkeit zur Infektion von Zellen besaßen, was bewies, dass die leuchtende Zugabe die Maschinerie des Virus nicht beschädigt hatte. Um zu bestätigen, dass das Licht tatsächlich vom Virus selbst stammte und nicht von zufälligen schwebenden Partikeln, verwendeten die Forscher eine Hochleistungs-Imaging-Kamera, um Bilder der an Zellen haftenden Partikel aufzunehmen. Die Bilder zeigten deutlich erkennbare, leuchtende Punkte auf der Zelloberfläche, was bestätigte, dass die Viruspartikel tatsächlich ihr eigenes Licht mitführten.

Mit einer zuverlässigen Quelle leuchtender, sicherer Partikel wandte sich das Team dann der schwierigen Aufgabe zu, diese einzeln zu zählen. Unter Verwendung eines spezialisierten Durchflusszytometers – einer Maschine, die Partikel zählt und misst, während sie an einem Laser vorbeiströmen – mussten sie die Einstellungen so abstimmen, dass Objekte so klein wie HIV, die etwa einhundert Nanometer groß sind, sichtbar werden. Sie passten die Empfindlichkeit der Detektoren der Maschine an und legten einen spezifischen Schwellenwert fest, um Hintergrundrauschen zu ignorieren. Durch Tests der Maschine mit bekannter Größe von Kügelchen (Beads) und anschließend mit ihren eigenen leuchtenden Viren ermittelten sie die exakten Einstellungen, die nötig waren, um ein echtes Virus von der leeren Flüssigkeit, in der es schwamm, zu unterscheiden. Sie stellten fest, dass sie durch das Anheben des Detektionsschwellenwerts fast das gesamte Rauschen herausfiltern konnten, sodass ein leuchtendes Ereignis, wenn es auftrat, mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit tatsächlich ein Virus war.

Um zu beweisen, dass das System bereit für reale Fragestellungen war, testeten die Forscher dessen Fähigkeit, die Bindung von Antikörpern an die Oberfläche dieser Partikel zu detektieren. Sie erstellten drei verschiedene Versionen ihres leuchtenden Virus, die jeweils einen unterschiedlichen Virushülle trugen. Eines trug die Hülle des Vesikulären Stomatitis-Virus, eines trug das Spike-Protein des SARS-CoV-2-Virus und das dritte trug das Hüllprotein von HIV. Sie fügten dann spezifische Antikörper hinzu, die darauf ausgelegt waren, genau an diese verschiedenen Hüllen zu binden. Die Antikörper wurden mit einer anderen Farbe markiert, damit die Maschine sie erkennen konnte. Als sie die Proben durch die Maschine laufen ließen, sahen sie, dass die Antikörper erfolgreich an die leuchtenden Partikel banden. Bei der Hülle des Vesikulären Stomatitis-Virus fing der Antikörper etwa achtzig Prozent der Partikel ab. Bei den SARS-CoV-2- und HIV-Hüllen fing der Antikörper etwa die Hälfte der Partikel ab.

Die Tatsache, dass der Antikörper nicht jedes einzelne Partikel erfassen konnte, war kein Versagen der Maschine, sondern eine Offenbarung über das Virus selbst. Die Forscher beobachteten, dass die Partikel variierten darin, wie viel Hüllprotein sie trugen und wie zugänglich dieses Hüllprotein war. Einige Partikel könnten sehr wenige Spikes besitzen, oder die Spikes könnten so gefaltet sein, dass das Ziel für den Antikörper verborgen bleibt. Diese Variation tritt selbst unter genetisch identischen Viren auf. Das neue System ermöglichte es dem Team, diese Diversität direkt zu beobachten. Sie konnten zwischen Partikeln unterscheiden, die vollständig beschichtet und bereit zum Einfangen waren, und solchen, die nur teilweise beschichtet waren oder das Ziel ganz vermissen ließen. Sie bestätigten zudem, dass die leuchtenden Partikel echte Viren mit einer schützenden Außenmembran waren, denn als sie die Probe mit einem Detergens behandelten, das Membranen auflöst, sank die Anzahl der leuchtenden Partikel signifikant, was zeigte, dass das Licht von intakten, membranumschlossenen Strukturen stammte.

Diese Arbeit etabliert eine neue Plattform für die Untersuchung der verborgenen Diversität von Viren. Durch die Kombination eines sicheren, nicht-replizierenden Virus-Backbones mit eingebauten Leuchtmarkern haben die Forscher ein Werkzeug geschaffen, das dazu verwendet werden kann, zu analysieren, wie verschiedene Antikörper mit einzelnen Viruspartikeln interagieren. Dieser Ansatz vermeidet die Notwendigkeit gefährlicher, voll infektionsfähiger Viren und eliminiert die Verwirrung durch unspezifische Farbstoffe. Das System ist vielseitig genug, um die Virushülle auszutauschen, was es Wissenschaftlern ermöglicht, HIV, SARS-CoV-2 oder andere Viren mit demselben zugrunde liegenden Partikel zu untersuchen. Diese Fähigkeit öffnet die Tür zum Verständnis darüber, warum einige Viren gegenüber Antikörperangriffen bestehen können, während andere nicht, und bietet eine klarere Sicht auf die nicht-genetischen Unterschiede, die das Überleben und die Persistenz von Viren antreiben.