A Third-generation Lentiviral Vector System for Flow Virometry-based Analysis of HIV-1 Env and Other Viral Envelope Proteins

Virussen zijn geen uniforme machines; het zijn zwermen individuele deeltjes die er anders uit kunnen zien en anders kunnen handelen, zelfs wanneer ze exact dezelfde genetische code dragen. Deze verborgen variëteit, bekend als niet-genetische diversiteit, komt voort uit het feit dat de omgeving binnen een cel bepaalt hoe een virus wordt opgebouwd. Voor het menselijk immuundeficiëntievirus, of HIV, is deze variatie een grote hindernis. Zelfs wanneer wetenschappers krachtige antilichamen ontwerpen om zich vast te klampen aan een virus en het infecteren van cellen te stoppen, glipt een klein deel van de virale zwerm vaak door de mazen van het net. Deze hardnekkige deeltjes blijven infectieus ondanks de aanwezigheid van het antilichaam, wat de mogelijkheid biedt aan het virus om zich te verstoppen en te overleven. Om te begrijpen waarom sommige deeltjes ontsnappen terwijl anderen worden gevangen, moeten onderzoekers naar individuele virussen kijken, één voor één, in plaats van de hele groep als een enkele massa te bestuderen.

De uitdaging bij het doen hiervan is dat virussen ongelooflijk klein zijn, vaak te klein om duidelijk te worden gezien door standaard microscopen of om onderscheid gemaakt te kunnen worden van het stof en vuil dat van nature in vloeibare monsters zweeft. Hoewel wetenschappers hulpmiddelen hebben ontwikkeld om deze minuscule deeltjes te tellen, vereisten eerdere methoden vaak het gebruik van gevaarlijke, volledig infectieuze versies van het virus, wat de mogelijkheden voor wie dit kan bestuderen en waar beperkt. Anderen vertrouwden op het bevestigen van virussen aan grotere kralen of het gebruik van kleurstoffen die alles verven, waardoor het moeilijk werd om een echt virus te onderscheiden van een stukje cellulair afval. Om dit op te lossen, heeft een team onderzoekers in Duitsland een nieuwe, veiligere tool gebouwd waarmee ze individuele virale deeltjes voorbij kunnen zien zweven, kunnen oplichten en kunnen interageren met antilichamen zonder het risico op het veroorzaken van een gevaarlijke infectie.

De onderzoekers begonnen met een lentivirale vector van de derde generatie, een type virusgebaseerd leveringsinstrument dat al breed wordt gebruikt in onderzoek, maar die is aangepast om veel veiliger te zijn. In dit systeem kan het virus een cel binnendringen en een boodschap afleveren, maar kan het geen nieuwe kopieën van zichzelf bouwen om de infectie te verspreiden. Om deze deeltjes zichtbaar te maken, plaatsten de onderzoekers een gen voor een gloeiend eiwit direct in de eigen structurele schil van het virus. Ze kozen ervoor om dit gloeiende gen tussen twee specifieke secties van het belangrijkste bouwblok van het virus te plaatsen, geflankeerd door moleculaire scharen die het virus van nature met zich meedraagt. Terwijl het virus rijpt, knippen deze moleculaire scharen het gloeiende eiwit vrij, waardoor het direct in de wand van het deeltje wordt ingebed. Dit betekent dat elk virus dat met dit nieuwe systeem wordt gemaakt, met zijn eigen interne licht gloeit, of dat nu groen of rood is, zonder dat er een externe kleurstof nodig is.

Omdat het virus niet uit zichzelf kan reproduceren, is het veilig om te hanteren in standaardlaboratoria. Het team produceerde deze gloeiende deeltjes en testte of ze nog steeds werkten zoals bedoeld. Ze ontdekten dat hoewel de gloeiende deeltjes in iets kleinere aantallen werden geproduceerd dan de niet-gloeiende, ze nog steeds in voldoende hoeveelheden werden gemaakt voor studie. Cruciaal was dat de deeltjes hun vermogen behielden om cellen te infecteren, wat bewees dat de gloeiende toevoeging de machinerie van het virus niet beschadigde. Om te bevestigen dat het licht van het virus zelf kwam en niet van willekeurige zwevende deeltjes, gebruikten de onderzoekers een camera met een hoog vermogen om foto's te maken van de deeltjes die aan cellen gehecht zijn. De beelden toonden duidelijke, gloeiende puntjes op het celoppervlak, wat bevestigde dat de virusdeeltjes inderdaad hun eigen licht met zich mee droegen.

Met een betrouwbare bron van gloeiende, veilige deeltjes richtte het team zich vervolgens op de moeilijke taak om ze individueel te tellen. Met behulp van een gespecialiseerde flowcytometer, een machine die deeltjes telt en meet terwijl ze langs een laser stromen, moesten ze de instellingen afstemmen om objecten te zien die zo klein zijn als HIV, die ongeveer honderd nanometer breed zijn. Ze pasten de gevoeligheid van de detectoren van de machine aan en stelden een specifieke drempelwaarde in om achtergrondruis te negeren. Door de machine te testen met kralen van bekende grootte en vervolgens met hun eigen gloeiende virussen, bepaalden ze de exacte instellingen die nodig waren om een echt virus te onderscheiden van de lege vloeistof waarin het zwom. Ze ontdekten dat door de detectiedrempel te verhogen, ze bijna alle ruis konden wegfilteren, waardoor ze er zeker van waren dat wanneer ze een gloeiende gebeurtenis zagen, dit bijna zeker een virus was.

Om te bewijzen dat het systeem klaar was voor praktische vragen, testten de onderzoekers het vermogen om te detecteren hoe antilichamen binden aan het oppervlak van deze deeltjes. Ze maakten drie verschillende versies van hun gloeiende virus, die elk een andere virale mantel droegen. De ene droeg de mantel van een vesicular stomatitis virus, een andere de spike-proteïne van het SARS-CoV-2 virus, en de derde het envelop-eiwit van HIV. Vervolgens voegden ze specifieke antilichamen toe die ontworpen zijn om zich aan elk van deze mantels vast te klampen. De antilichamen waren voorzien van een andere kleur zodat de machine ze kon zien. Wanneer ze de monsters door de machine lieten lopen, zagen ze dat de antilichamen succesvol aan de gloeiende deeltjes hechtten. Voor de mantel van het vesicular stomatitis virus ving het antilichaam ongeveer tachtig procent van de deeltjes. Voor de SARS-CoV-2 en HIV-mantels ving het antilichaam ongeveer de helft van de deeltjes.

Het feit dat het antilichaam niet elk deeltje ving, was geen falen van de machine, maar een onthulling over het virus zelf. De onderzoekers observeerden dat de deeltjes varieerden in de hoeveelheid mantelproteïne die ze droegen en hoe toegankelijk die mantel was. Sommige deeltjes hebben misschien heel weinig spikes, of de spikes zijn op een manier gevouwen die het doelwit voor het antilichaam verbergt. Deze variatie vindt plaats, zelfs onder genetisch identieke virussen. Het nieuwe systeem stelde het team in staat om deze diversiteit direct te zien. Ze konden onderscheid maken tussen deeltjes die volledig bekleed waren en klaar waren om gevangen te worden, en deeltjes die gedeeltelijk bekleed waren of het doelwit volledig misten. Ze bevestigden ook dat de gloeiende deeltjes echte virussen waren met een beschermend buitenmembraan, want wanneer ze de monsters behandelden met een detergent die membranen oplost, nam het aantal gloeiende deeltjes aanzienlijk af, wat aantoonde dat het licht afkomstig was van intacte, door een membraan omsloten structuren.

Dit werk vestigt een nieuw platform voor het bestuderen van de verborgen diversiteit van virussen. Door een veilige, niet-replicerende virale ruggengraat te combineren met ingebouwde gloeiende markers, hebben de onderzoekers een instrument gecreëerd dat kan worden gebruikt om te analyseren hoe verschillende antilichamen interageren met individuele virale deeltjes. Deze aanpak vermijdt de noodzaak van gevaarlijke, volledig infectieuze virussen en elimineert de verwarring veroorzaakt door niet-specifieke kleurstoffen. Het systeem is veelzijdig genoeg om de virale mantel te verwisselen, waardoor wetenschappers HIV, SARS-CoV-2 of andere virussen kunnen bestuderen met hetzelfde onderliggende deeltje. Deze capaciteit opent de deur naar het begrijpen van waarom sommige virussen ontsnappen aan aanvallen door antilichamen terwijl anderen dat niet doen, wat een helderder beeld geeft van de niet-genetische verschillen die virale overleving en persistentie drijven.