A Third-generation Lentiviral Vector System for Flow Virometry-based Analysis of HIV-1 Env and Other Viral Envelope Proteins
Questo articolo presenta un sistema di vettori lentivirali di terza generazione che incorpora proteine fluorescenti nella poliproteina Gag di HIV-1 per consentire un'analisi di citometria virale a singola particella ad alta biosicurezza delle proteine dell'envelope virale e della loro diversità non genetica attraverso la pseudotipizzazione flessibile.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
I virus non sono macchine uniformi; sono stormi di particelle individuali che possono apparire e comportarsi diversamente anche quando trasportano lo stesso identico codice genetico. Questa varietà nascosta, nota come diversità non genetica, si verifica perché l'ambiente all'interno di una cellula modella il modo in cui un virus viene costruito. Per l'immunodeficienza umana, o HIV, questa variazione rappresenta un ostacolo maggiore. Anche quando gli scienziati progettano potenti anticorpi per agganciarsi a un virus e impedirgli di infettare le cellule, una piccola frazione dello stormo virale riesce spesso a passare indisturbata. Queste particelle persistenti rimangono infettive nonostante la presenza dell'anticorpo, permettendo potenzialmente al virus di nascondersi e sopravvivere. Per capire perché alcune particelle sfuggano mentre altre vengano catturate, i ricercatori devono osservare i singoli virus uno alla volta, piuttosto che studiare l'intero gruppo come una singola massa.
La sfida nel farlo è che i virus sono incredibilmente piccoli, spesso troppo minuscoli per essere visti chiaramente con i microscopi standard o per essere distinti dalla polvere e dai detriti che galleggiano naturalmente nei campioni liquidi. Sebbene gli scienziati abbiano sviluppato strumenti per contare queste minuscole particelle, i metodi precedenti richiedevano spesso l'uso di versioni del virus completamente infettive e pericolose, il che limita chi può studiarli e dove. Altri si affidavano all'aggancio dei virus a microsfere più grandi o all'uso di coloranti che tingono tutto, rendendo difficile distinguere un vero virus da un pezzo di spazzatura cellulare. Per risolvere questo problema, un team di ricercatori in Germania ha costruito un nuovo strumento più sicuro che permette loro di osservare le singole particelle virali che fluttuano, si illuminano e interagiscono con gli anticorpi senza il rischio di creare un'infezione pericolosa.
I ricercatori sono partiti con un sistema di vettore lentivirale di terza generazione, un tipo di strumento di consegna basato su virus che è già ampiamente utilizzato nella ricerca, ma che è stato modificato per essere molto più sicuro. In questo sistema, il virus può entrare in una cella e consegnare un messaggio, ma non può costruire nuove copie di se stesso per diffondere l'infezione. Per rendere visibili queste particelle, il team ha inserito un gene per una proteina fluorescente direttamente nel guscio strutturale del virus stesso. Hanno scelto di posizionare questo gene fluorescente tra due sezioni specifiche del principale elemento costruttivo del virus, fiancheggiandolo con le "forbici molecolari" che il virus trasporta naturalmente. Mentre il virus matura, queste forbici staccano la proteina fluorescente, incorporandola direttamente nella parete della particella. Ciò significa che ogni virus prodotto con questo nuovo sistema brilla con la propria luce interna, sia essa verde o rossa, senza bisogno di alcun colorante esterno.
Poiché il virus non può riprodursi da solo, è sicuro da manipolare in laboratori standard. Il team ha prodotto queste particelle luminose e ha testato se funzionassero ancora come previsto. Hanno scoperto che, sebbene le particelle luminose venissero prodotte in numeri leggermente inferiori rispetto a quelle non luminose, venivano comunque prodotte in quantità sufficienti per lo studio. Fondamentalmente, le particelle hanno mantenuto la loro capacità di infettare le cellule, dimostrando che l'aggiunta della fluorescenza non aveva danneggiato il meccanismo virale. Per confermare che la luce provenisse dal virus stesso e non da frammenti casuali galleggianti, i ricercatori hanno utilizzato una fotocamera per l'imaging ad alta potenza per scattare foto delle particelle attaccate alle cellule. Le immagini hanno mostrato distinti punti luminosi situati sulla superficie cellulare, confermando che le particelle virali trasportavano effettivamente la propria luce.
Con una fonte affidabile di particelle sicure e luminose, il team si è poi dedicato al difficile compito di contarle singolarmente. Utilizzando un citometro a flusso specializzato, una macchina che conta e misura le particelle mentre scorrono davanti a un laser, hanno dovuto regolare le impostazioni per vedere oggetti grandi quanto l'HIV, che misurano circa cento nanometri. Hanno regolato la sensibilità dei rilevatori della macchina e impostato una soglia specifica per ignorare il rumore di fondo. Testando la macchina con microsfere di dimensioni note e poi con i propri virus luminosi, hanno determinato le impostazioni esatte necessarie per distinguere un vero virus dal liquido vuoto in cui nuotava. Hanno scoperto che, alzando la soglia di rilevamento, potevano filtrare quasi tutto il rumore, assicurando che ogni volta che vedevano un evento luminoso, si trattasse quasi certamente di un virus.
Per dimostrare che il sistema fosse pronto per domande del mondo reale, i ricercatori hanno testato la sua capacità di rilevare come gli anticorpi si legano alla superficie di queste particelle. Hanno creato tre diverse versioni del loro virus luminoso, ognuna con un rivestimento virale differente. Una indossava il rivestimento di un virus della stomatite vescicolare, un'altra la proteina spike del virus SARS-CoV-2 e la terza la proteina dell'envelope dell'HIV. Hanno poi aggiunto anticorpi specifici progettati per aggrapparsi a ciascuno di questi rivestimenti. Gli anticorpi erano marcati con un colore diverso in modo che la macchina potesse vederli. Quando hanno fatto passare i campioni attraverso la macchina, hanno visto che gli anticorpi si agganciavano con successo alle particelle luminose. Per il rivestimento del virus della stomatite vescicolare, l'anticorpo ha catturato circa l'ottanta per cento delle particelle. Per i rivestimenti di SARS-CoV-2 e HIV, l'anticorpo ha catturato circa la metà delle particelle.
Il fatto che l'anticorpo non avesse catturato ogni singola particella non era un fallimento della macchina, ma una rivelazione sull'aspetto del virus stesso. I ricercatori hanno osservato che le particelle variavano nel modo in cui trasportavano la proteina del rivestimento e in quanto tale rivestimento fosse accessibile. Alcune particelle potrebbero avere pochissime spine, o le spine potrebbero essere ripiegate in un modo che nasconde il bersaglio per l'anticorpo. Questa variazione avviene anche tra virus geneticamente identici. Il nuovo sistema ha permesso al team di vedere direttamente questa diversità. Potevano distinguere tra particelle completamente rivestite e pronte per essere catturate, e quelle parzialmente rivestite o prive del bersaglio. Hanno anche confermato che le particelle luminose erano veri virus con una membrana esterna protettiva, poiché trattando il campione con un detergente che dissolve le membrane, il numero di particelle luminose diminuiva significativamente, dimostrando che la luce proveniva da strutture intatte e racchiuse in una membrana.
Questo lavoro stabilisce una nuova piattaforma per lo studio della diversità nascosta dei virus. Combinando un backbone virale sicuro e non replicante con marcatori luminosi integrati, i ricercatori hanno creato uno strumento che può essere utilizzato per analizzare come diversi anticorpi interagiscono con le singole particelle virali. Questo approccio evita la necessità di utilizzare virus pienamente infettivi e pericolosi ed elimina la confusione causata dai coloranti non specifici. Il sistema è abbastanza versatile da poter sostituire il rivestimento virale, consentendo agli scienziati di studiare l'HIV, il SARS-CoV-2 o altri virus utilizzando la stessa struttura sottostante. Questa capacità apre la porta alla comprensione del motivo per cui alcuni virus sfuggono agli attacchi anticorpali mentre altri no, fornendo una visione più chiara delle differenze non genetiche che guidano la sopravvivenza e la persistenza virale.
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