Structure-resolved fold annotation of the medicinal-leech salivary-EV cargo: a Ly-6/uPAR three-finger scaffold and a structurally dark fraction
यह अध्ययन औषधीय जोंक *Hirudinaria manillensis* के अनिश्चित लार बाह्यकोशिकीय पुटिका (एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल) कार्गो को एनोटेट करने के लिए एक ऑफलाइन संरचना भविष्यवाणी और खोज पाइपलाइन का उपयोग करता है, जो एक संभावित उम्मीदवार को Ly-6/uPAR थ्री-फिंगर फोल्ड प्रदान करने में सफल रहा है और साथ ही दो संरचनात्मक रूप से अनसुलझे प्रोटीनों की पहचान करने और एक संरक्षित ट्रिप्सिन-जैसे जीन मॉडल को मान्य करने में भी सफल रहा है।
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जोंछों (leeches) का उपयोग सदियों से चिकित्सा में किया जाता रहा है, न केवल रक्त निकालने के लिए, बल्कि इसलिए भी क्योंकि उनके लार में रसायनों का एक शक्तिशाली मिश्रण होता है जो रक्त को जमने से रोकता है। आधुनिक विज्ञान लंबे समय से जानता है कि ये जीव इन सहायक रसायनों के कई अंशों को छोटे, बुलबुले जैसे कंटेनरों में पैक करते हैं जिन्हें बाह्यकोशिकीय पुटिकाएं (extracellular vesicles) कहा जाता है, और वे इन्हें अपनी लार में छोड़ते हैं। हालाँकि, इन बुलबुलों के भीतर मौजूद प्रोटीनों का एक बड़ा हिस्सा अभी भी रहस्य बना हुआ है। वैज्ञानिक उन्हें पहचान सकते हैं और जानते हैं कि वे बड़ी संख्या में वहां मौजूद हैं, लेकिन जब वे इन प्रोटीनों के लिए आनुवंशिक निर्देशों (genetic instructions) को देखते हैं, तो वह कोड निरर्थक या अस्पष्ट दिखाई देता है। वहां कोई पहचानने योग्य पैटर्न या ज्ञात परिवार के नाम नहीं हैं जो शोधकर्ताओं को यह बता सकें कि ये प्रोटीन क्या कार्य करते हैं या उनका आकार क्या है। ज्ञान का यह अभाव जोंछ के औषधीय सामर्थ्य के एक महत्वपूर्ण हिस्से को अनछुआ छोड़ देता है, क्योंकि जब आनुवंशिक कोड कोई सुराग नहीं देता, तो अक्सर प्रोटीन के आकार को समझना ही उसके कार्य का अनुमान लगाने का एकमात्र तरीका होता है।
शोधकर्ताओं की एक टीम ने औषधीय जोंछ हिरुडिना मैनिलीन्स (Hirudinaria manillensis) की लार की पुटिकाओं के भीतर की सामग्री की जांच करके इस विशिष्ट पहेली को सुलझाने का प्रयास किया। उन्होंने सत्रह प्रोटीनों की एक सूची के साथ शुरुआत की जो लार में असामान्य रूप से उच्च मात्रा में पाए गए थे लेकिन जिनकी कोई ज्ञात पहचान नहीं थी। इन "डार्क" प्रोटीनों को समझने के लिए, वैज्ञानिकों ने एक ऐसी विधि का उपयोग किया जो केवल उनके आनुवंशिक अनुक्रम के बजाय अणुओं की भौतिक संरचना पर ध्यान केंद्रित करती है। उन्होंने इन प्रोटीनों के त्रि-आयामी (3D) स्वरूप की भविष्यवाणी करने के लिए शक्तिशाली कंप्यूटर प्रोग्रामों का उपयोग किया और फिर उन अनुमानित आकारों की तुलना ज्ञात प्रोटीन संरचनाओं के एक विशाल पुस्तकालय से की। लक्ष्य यह देखना था कि क्या किसी रहस्यमय प्रोटीन का आकार उसकी पहचान प्रकट कर सकता है, भले ही उसका आनुवंशिक कोड मौन रहे।
अध्ययन ने इन रहस्यमय प्रोटीनों के एक छोटे समूह पर ध्यान केंद्रित किया जो सिस्टीन (cysteine) से विशेष रूप से समृद्ध थे, जो एक ऐसा निर्माण खंड है जो आंतरिक पुल बनाकर प्रोटीनों को अपना आकार बनाए रखने में मदद करता है। उम्मीदवारों में से, एक प्रोटीन तुरंत अलग दिखा। कंप्यूटर ने भविष्यवाणी की कि यह प्रोटीन, जिसे g21166 के रूप में जाना जाता है, एक बहुत ही विशिष्ट और पहचानने योग्य आकार में मुड़ता है जिसे 'थ्री-फिंगर फोल्ड' (three-finger fold) कहा जाता है। इस आकार का नाम इसकी उपस्थिति के कारण रखा गया है, जो तीन उंगलियों वाले हाथ के समान दिखता है, और यह कई पशु विषों और संकेतक अणुओं में पाया जाने वाला एक सामान्य ढांचा है। शोधकर्ताओं ने पाया कि जोंछ के प्रोटीन का अनुमानित आकार अन्य जानवरों में ज्ञात संरचनाओं के साथ उच्च सटीकता के साथ मेल खाता है, विशेष रूप से उन प्रोटीनों के समूह के साथ जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं और तंत्रिका रिसेप्टर्स के साथ परस्पर क्रिया करते हैं। यह एक महत्वपूर्ण सफलता थी क्योंकि इसने एक ऐसे प्रोटीन को, जो पहले केवल अपरिचित अक्षरों की एक श्रृंखला मात्र था, एक ठोस वास्तुशिल्प पहचान प्रदान की। हालाँकि, शोधकर्ताओं ने सावधानीपूर्वक यह नोट किया कि आकार जानने का अर्थ कार्य का स्वतः पता चलना नहीं है; जबकि यह आकार अक्सर विशिष्ट जैविक गतिविधियों से जुड़ा होता है, इस जोंछ प्रोटीन के सटीक कार्य का प्रयोगशाला में परीक्षण किया जाना अभी बाकी है।
हर रहस्य इतनी आसानी से हल नहीं हुआ। सिस्टीन-समृद्ध समूह के दो अन्य प्रोटीन अभी भी जिद्दी रूप से अस्पष्ट बने रहे। यहाँ तक कि जब वैज्ञानिकों ने अन्य जीवों में संबंधित आनुवंशिक अनुक्रमों को खोजकर अपने कंप्यूटर मॉडल को बेहतर बनाने के लिए उन्नत तकनीकों का उपयोग किया, तब भी ये दो प्रोटीन डेटाबेस में किसी भी ज्ञात संरचना से मेल नहीं खा सके। उनमें से एक का कोई आनुवंशिक संबंधी नहीं था जिससे मॉडलिंग में मार्गदर्शन मिल सके, जबकि दूसरे के कई संबंधी थे लेकिन फिर भी वह सिमुलेशन में कोई पहचानने योग्य आकार बनाने में विफल रहा। शोधकर्ताओं ने निष्कर्ष निकाला कि ये दो प्रोटीन अलग-अलग कारणों से संरचनात्मक रूप से अनसुलझे हैं, लेकिन उन्होंने स्पष्ट रूप से कहा कि इनमें से कोई भी परिणाम एक नवीन फोल्ड (novel fold) को प्रदर्शित नहीं करता है; मिलान का अभाव उपयोग किए गए भविष्यवाणी मॉडलों या डेटाबेस की सीमाओं के कारण हो सकता है, न कि एक पूरी तरह से नए आकार के अस्तित्व के कारण।
सूची में मौजूद एक अन्य प्रोटीन, g8114, ने एक अलग प्रकार की पहेली पेश की। यह प्रोटीन एक बड़ा, जटिल अणु प्रतीत हुआ जिसमें ऐसे खंड शामिल थे जो एंजाइमों की तरह दिखते हैं जो अन्य प्रोटीनों को काटने में सक्षम हैं। शोधकर्ताओं ने तीन अलग-अलग जोंछ प्रजातियों के जीनोम में इस प्रोटीन के आनुवंशिक ब्लूप्रिंट का पता लगाया और पाया कि मूल संरचना संरक्षित थी, जिसका अर्थ है कि इसे विकास के माध्यम से सुरक्षित रखा गया था। उन्हें इस बात के प्रमाण भी मिले कि इस प्रोटीन के लिए आनुवंशिक निर्देश जोंछ के सिर में सही ढंग से स्प्लिस (splice) किए गए हैं, जो यह दर्शाता है कि यह एक वास्तविक, कार्यात्मक अणु है। हालाँकि, अध्ययन यह पुष्टि नहीं कर सका कि क्या प्रोटीन पूरी तरह से सक्रिय है या क्या यह एक विशिष्ट काटने वाला कार्य करता है, क्योंकि सभी प्रजातियों में पूर्ण आनुवंशिक निर्देश पूरी तरह से सत्यापित नहीं थे।
शोधकर्ताओं ने यह परीक्षण करने का भी प्रयास किया कि क्या ये प्रोटीन मानव शरीर के विशिष्ट लक्ष्यों, जैसे कि थ्रॉम्बिन (thrombin) एंजाइम, जो रक्त के थक्के जमने के लिए केंद्रीय है, या तंत्रिका संकेतन में शामिल रिसेप्टर्स के साथ परस्पर क्रिया करते हैं। उन्होंने यह देखने के लिए कंप्यूटर सिमुलेशन चलाए कि क्या जोंछ के प्रोटीन इन लक्ष्यों से जुड़ते हैं। परिणाम अनिर्णायक रहे। सिमुलेशन ने इन लक्ष्यों से जुड़ने के लिए प्रोटीनों के मजबूत साक्ष्य नहीं दिखाए, और शोधकर्ताओं ने उल्लेख किया कि उपयोग की गई विधियाँ निर्णायक दावा करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं थीं। फलस्वरूप, उन्होंने यह निष्कर्ष नहीं निकाला कि ये प्रोटीन रक्त पतला करने वाले या तंत्रिका मॉडुलर के रूप में कार्य करते हैं, और उन प्रश्नों को भविष्य के प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए खुला छोड़ दिया।
अंततः, यह कार्य ज्ञात संरचनाओं के आधार पर सत्रह रहस्यमय प्रोटीनों को तीन समूहों में विभाजित करके भविष्य के अनुसंधान के लिए एक स्पष्ट मार्गप्रदान (roadmap) प्रदान करता है। शीर्ष प्राथमिकता उन तीन छोटे, स्रावित प्रोटीनों के समूह की है जो सिस्टीन से समृद्ध हैं। इनमें से एक को सफलतापूर्वक 'थ्री-फिंगर' आकार के रूप में पहचाना गया है, जबकि अन्य दो संरचनात्मक रहस्य बने हुए हैं जिन्हें संभवतः हल करने के लिए नई प्रयोगात्मक विधियों की आवश्यकता होगी। दूसरा समूह उन बड़े, जटिल प्रोटीन का है जिनमें एंजाइम-जैसे खंड होते हैं, जो आगे के अध्ययन के लिए एक उम्मीदवार है लेकिन जिसमें कार्य की पुष्टि नहीं हुई है। तीसरा समूह उन प्रोटीनों का है जो प्रचुर मात्रा में हैं लेकिन सक्रिय औषधीय एजेंटों के बजाय आंतरिक कोशिकीय मशीनरी की तरह प्रतीत होते हैं। संरचना का उपयोग करके खोज को निर्देशित करके, शोधकर्ताओं ने केवल अज्ञात की सूचियों से आगे बढ़कर, शोधकर्ताओं के अध्ययन के लिए सबसे आशाजनक उम्मीदवारों की एक प्राथमिकता वाली सूची तैयार की है, जिससे आनुवंशिक शोर के बादल को मूर्त, त्रि-आयामी लक्ष्यों के सेट में बदल दिया गया है।
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