Structure-resolved fold annotation of the medicinal-leech salivary-EV cargo: a Ly-6/uPAR three-finger scaffold and a structurally dark fraction

技術要約：医用ヒル唾液由来EVカーゴの構造解析によるフォールド注釈

問題提起
医用ヒル（Hirudinaria manillensis）は、薬理学的に豊かなプロテオームを細胞外小胞（EV）を介して分泌する。付随する比較プロテオミクス研究により、17個の超濃縮された候補EVカーゴタンパク質が特定されたが、そのうちの数個は「シーケンス・ダーク（配列による注釈が困難）」であり、解釈可能な配列レベルの注釈（例：Pfamドメイン）や注釈付きホモログを欠いていた。機能的な仮説が得られないため、これらのタンパク質の特性評価は困難である。著者らは、配列ベースの手法が失敗する場合において、構造予測と構造検索を用いることで、これら未注釈の候補に対してフォールド（立体構造の型）を割り当てることができるか、また、厳格に事前定義された基準の下で、どの候補が構造的に未解決のまま残るのかを検討している。

手法
本研究では、オンラインサーバーへの依存を回避し再現性を確保するため、完全にオフラインかつ基準に基づいた計算パイプラインを採用している：

1. 候補の選択: 付随する研究（Zhao et al., 査読中）でノミネートされた17個の候補を抽出した。1つの候補（g18761.t1, 3,570 aa）は、フォールディング中のハードウェアメモリ制限のため除外した。分析対象は16個となった。
2. 構造予測:
   • ESMFold: 全16個の候補に対してシングルシーケンスモデルを生成した。
   • Boltz-2 (AlphaFold3ベース): ホモログ情報を利用したモデリングに使用した。具体的には、候補g436に対し、UniRef90からの深い多重配列アライメント（MSA）を用いたもの（深度103）と、空のMSA（クエリのみ）を用いたものの2つのモデリング・アームを実行し、ホモログ情報の有無がモデルの信頼性に与える影響をテストした。
3. フォールドの割り当ておよび構造検索:
   • TM-align: 標準的な参照パネル（例：Kunitz、Kazal、three-finger toxin）に対するペアワイズ・アライメントを実施した。正規化されたTMスコア $\ge$ 0.5の場合にのみ、フォールドを割り当てた。
   • Foldseek: 予測構造をAFDB-SwissProtおよびPDB100データベースに対して検索した。「有意な一致」の条件は、全報告されたヒット全体に対して、アライメントTMスコア（alnTM） $\ge$ 0.5 かつ E値 $\le$ 0.05 であることとした。
4. 遺伝子構造および転写産物サポート: 候補g8114について、エキソン・イントロンの保存性を評価するため、3つのヒル類のアセンブリに対するタンパク質—ゲノムアライメントを行った。スプライスジャンクションは、頭部および唾液腺ライブラリからの公開RNA-seqデータを用いて検証した。
5. 標的結合（パイロット）: ボルツ-2（Boltz-2）を用いたトロンビンに対するインターフェース・テスト、およびAlphaFold3-multimerを用いたニコチン受容体サロゲートに対するテストを試みた。トロンビン・パイロットは実行されたが、ニコチン受容体テストは、有効なヌルモデルを構築できなかったため「判定不能」として終了した。

主な結果
17個の候補は、細胞内/膜装置成分と、分泌型のシステイン密な画分へと層別化された。構造解析から以下の具体的な知見が得られた：

• g21166 (Protein-sleepless ホモログ): Ly-6/uPAR three-finger フォールドへの割り当てに成功した。
  • ヒトCD59に対するTM-alignスコアは0.58、$\alpha$-bungarotoxinに対しては0.56であった。
  • AFDB-SwissProtに対するFoldseek検索では23個の有意な一致が見られ（最良：U-scoloptoxin, alnTM 0.630）、PDB100に対するFoldseek検索ではLynx1（PDB 2L03, alnTM 0.664）への有意な一致が得られた。
  • モデルは、three-fingerスキャフォールドと一致する5つのジスルフィド結合のペアリングを予測している。ただし、このフォールドは多様な活性（補体制御、受容体結合など）を支持するため、機能的な推論は行わなかった。
• g436 および g20791 ("ダーク" 画分): 両候補は、本研究の基準の下で構造的に未解決のままとなった。
  • g20791: UniRef90（深度1）においてホモログが見つからなかった。ESMFoldモデルは低信頼度（pLDDT 0.30）を示し、有意な構造的一致も得られなかった。
  • g436: UniRef90において102個のホモログが見つかった。このMSAをBoltz-2モデリングに組み込むことで、モデルの信頼性（平均pLDDTが0.47から0.71へ）は、特に成熟領域において大幅に向上した。しかし、高信頼度のホモログ情報を用いたモデルであっても、AFDB-SwissProtおよびPDB100のいずれにおいても有意な構造的一致（alnTM $\ge$ 0.5, E $\le$ 0.05）は得られなかった。
  • 結論： g436における一致の欠如は、単なるホモログ情報の不足やモデルの信頼性の低さに起因するものではない。これは、現在のデータベースおよび予測精度を条件とした「非検出」であり、新規フォールドの証明ではない。
• g8114 (トリプシン様タンパク質): この大型の分泌タンパク質は、他のモジュールによって隔てられた2つのトリプシン様ドメインを含んでいる。
  • ゲノムアライメントにより、3種間での保存された遺伝子座が確認されたが、外群の配列にはフレームシフトが含まれていた。
  • 頭部組織のRNA-seqデータは、中間領域のスプライシングを支持したが、完全な転写産物や活性のある触媒ユニットは確立されなかった。
  • 標的結合に関する主張は行われなかった。
• 標的結合: トロンビンに対するg21166のパイロットテストは、シード感受性の結果を示したが、結合の主張を裏付けるには再現性が不十分であった。ニコチン受容体テストは中断された。著者らは、どの候補に対しても正の標的結合の主張は行わないことを明記している。

意義および主張
本論文は、豊富さではなく構造的新規性と解決可能性に焦点を当てることで、実験的なフォローアップのための構造情報に基づくショートリストを提供することを主張している：

1. シーケンス・ダークなタンパク質の解決: 本研究は、g21166の「未特性化」というラベルを、特定のフォールド仮説（Ly-6/uPAR three-finger）へと変換することに成功し、構造ベースの注釈がシーケンス・ダークなカーゴを解決できることを示した。
2. 「ダーク」の原因の区別: 本研究は、ホモログの欠如によるダークな候補（g20791）と、ホモログが存在し高信頼度のモデリングが可能であるにもかかわらず未解決のままである候補（g436）を区別した。これは、g436が実験的な構造決定（例：結晶学）にとってより優先度の高いターゲットであることを示唆しており、その未解決性はデータの欠落によるアーティファクトである可能性が低いことを意味する。
3. 方法論的枠組み: データをオンラインサーバーに送信することなく、未発表のプロテオームに適用できる、基準に基づいたオフラインのワークフロー（TM $\ge$ 0.5, alnTM $\ge$ 0.5, E $\le$ 0.05）を提案している。
4. 主張の慎重さ: 著者らは、フォールドから機能を推論すること（Ly-6/uPARスーパーファミリーの機能的多様性に言及）を避け、またg436やg20791の新規フォールドの発見を主張せず、単にそれらが現在の条件下で未解決であることを述べている。標的結合のレイヤーについては、不完全かつ非確証的であると報告されている。

要約すると、本論文は、g21166にフォールドを割り当て、他の2つの候補の構造的不確実性を厳密に定義することにより、医用ヒルの唾液由来EVプロテオームの注釈を進め、将来の実験的検証のための優先順位付きリストを提供している。