GATOR2 regulates the nutrient-dependent recruitment of GATOR1 to lysosomes

Sintesi Tecnica: GATOR2 regola il reclutamento di GATOR1 ai lisosomi in modo dipendente dai nutrienti

Problematica
Il complesso Target of Rapamycin 1 (TORC1) è un regolatore centrale del metabolismo cellulare, che integra segnali provenienti da nutrienti, fattori di crescita e stato energetico. La sua attivazione è subordinata al reclutamento sulla superficie lisosomiale da parte delle GTPasi Rag. Questo reclutamento è governato dal complesso GATOR, che comprende due subcomplessi: GATOR1, una proteina attivante la GTPasi (GAP) che inibisce TORC1 convertendo RagA nel suo stato inattivo legato al GDP durante la carenza di nutrienti, e GATOR2, che antagonizza GATOR1 per promuovere l'attivazione di TORC1 in condizioni di abbondanza di nutrienti. Sebbene le componenti strutturali di questi complessi siano note, il meccanismo preciso attraverso il quale GATOR2 inibisce l'attività GAP di GATOR1 e come lo stato dei nutrienti regoli dinamicamente l'assemblaggio e il reclutamento di questi complessi al lisosoma in un organismo multicellulare rimane indefinito. Nello specifico, non è chiaro se le gerarchie regolatorie osservate nelle cellule di cultura tissutale di mammifero (come la necessità del complesso KICSTOR) siano conservate in Drosophila, e come il supercomplesso GATOR1-GATOR2 si comporti dinamicamente in risposta allo stress nutritivo in vivo.

Metodologia
Per affrontare queste domande, gli autori hanno sviluppato un toolkit genetico e di imaging completo in Drosophila melanogaster.

1. Marcatura Genomica: Utilizzando CRISPR/Cas9, gli autori hanno generato linee di moscerini omozigoti vitali con tag endogeni (ad es., V5, FLAG, T7, GFP11) su componenti chiave della via, tra cui le subunità di GATOR1 (iml1, nprl2, nprl3), le subunità di GATOR2 (mio, wdr24, wdr59) e le GTPasi Rag (ragA, ragC). Ciò ha garantito livelli di espressione nativi ed evitato artefatti associati alla sovraespressione.
2. Sistema Split-GFP: Per visualizzare le proteine endogene in tipi cellulari specifici senza il rumore di fondo dei tessuti circostanti, gli autori hanno impiegato una strategia split-GFP. Le proteine marcate genomicamente sono state fuse a GFP11, mentre GFP1-10 è stata espressa sotto driver tessuto-specifici (ad es., nos-Gal4 per la linea germinale, slbo-Gal4 per le cellule border). La ricostituzione del segnale GFP ha permesso una localizzazione subcellulare ad alta risoluzione.
3. Genetica Loss-of-Function: Gli autori hanno generato cloni mutanti omozigoti nulli nella linea germinale per varie componenti della via al fine di valutare la dipendenza del reclutamento lisosomiale tra GATOR1, GATOR2 e le GTPasi Rag.
4. Saggi Biochimici: L'immunoprecipitazione (IP) seguita da spettrometria di massa e Western blot è stata utilizzata per analizzare le interazioni proteina-proteina e la stabilità del complesso in ovari wild-type rispetto a mutanti wdr24 in condizioni di alimentazione e di digiuno.
5. Recupero della fluorescenza dopo fotodecolorazione (FRAP): Gli autori hanno eseguito il FRAP lisosomiale su ovari coltivati interi per misurare i tassi di scambio dinamico (frazioni mobili) delle componenti marcate di GATOR1, GATOR2 e Rag tra il lisosoma e il citoplasma in condizioni di alimentazione e di digiuno.
6. Validazione Cross-Specie: Esperimenti FRAP paralleli condotti in cellule HeLa trasfettate transientemente sono stati eseguiti per testare la conservazione delle dinamiche osservate nei sistemi mammiferi.

Contributi Chiave e Risultati

• Conservazione delle Gerarchie Regolatorie: Lo studio conferma che in Drosophila, la GTPasi Rag è necessaria per il reclutamento lisosomiale sia di GATOR1 che di GATOR2. Viceversa, GATOR1 e GATOR2 sono mutuamente dipendenti per la loro localizzazione lisosomiale. In particolare, gli autori hanno scoperto che Drosophila manca di omologhi del complesso KICSTOR (necessario per il reclutamento di GATOR1 nei mammiferi), ma la logica fondamentale del reclutamento rimane conservata.
• GATOR2 Mantiene GATOR1 in uno Stato Inattivo: L'analisi biochimica ha rivelato che in assenza di GATOR2 (specificamente nei mutanti wdr24), l'associazione tra la subunità catalitica di GATOR1 (Nprl2) e la subunità inibitoria (Iml1/DEPDC5) è significativamente ridotta. In condizioni wild-type, GATOR2 promuove un'associazione ad alta affinità tra Iml1 e il dimero eterodimerico Nprl2/Nprl3. Ciò suggerisce che GATOR2 stabilizzi GATOR1 in una conformazione GAP-inattiva in cui Iml1 lega RagA, prevenendo l'idrolisi del GTP.
• Disaccoppiamento del Supercomplesso Dipendente dai Nutrienti: L'analisi FRAP ha fornito prove dinamiche che GATOR1 e GATOR2 funzionano come un supercomplesso in condizioni di abbondanza di nutrienti, mostrando tassi di scambio lisosomiale simili. Tuttavia, in caso di digiuno, i loro comportamenti divergono:
  • GATOR1: La frazione mobile delle componenti di GATOR1 (Nprl2, Iml1) diminuisce significativamente, indicando che esse diventano più stabilmente associate al lisosoma (o meno scambiabili), coerentemente con la transizione verso uno stato GAP-attivo che ingaggia RagA-GTP.
  • GATOR2: Al contrario, la frazione mobile delle componenti core di GATOR2 (Mio, Wdr24) aumenta in seguito al digiuno, suggerendo una dissociazione dal supercomplesso lisosomiale.
• Il Ruolo Unico di Wdr59: Lo studio identifica Wdr59 come un regolatore critico che non si comporta come una componente core di GATOR2. In condizioni di alimentazione, la dinamica di Wdr59 rispecchia il supercomplesso GATOR1-GATOR2. Tuttavia, in seguito al digiuno, la dinamica di Wdr59 cambia, assumendo un comportamento simile a quello di GATOR1 (ridotta mobilità) piuttosto che a quello di GATOR2. Inoltre, nei mutanti wdr59, il disaccoppiamento indotto dal digiuno di GATOR1 e GATOR2 è abolito; GATOR1 rimane in uno stato in cui il suo reclutamento lisosomiale non cambia con lo stato dei nutrienti. Ciò suggerisce che Wdr59 sia necessario per alleviare l'inibizione mediata da GATOR2 e facilitare la transizione di GATOR1 al suo stato attivo.
• Conservazione nei Mammiferi: Gli esperimenti FRAP in cellule HeLa hanno riprodotto i risultati di Drosophila: il digiuno ha diminuito il reclutamento lisosomiale della componente di GATOR1 NPRL2 mentre ha aumentato il reclutamento della componente di GATOR2 WDR24, e WDR59 si è comportato in modo simile a GATOR1.

Significato
Questo articolo stabilisce un toolkit in vivo versatile per scomporre la regolazione di TORC1 a livello di singola cellula e subcellulare. Gli autori propongono un modello raffinato per la regolazione di GATOR: in condizioni di ricchezza di nutrienti, GATOR2 stabilizza GATOR1 in un supercomplesso GAP-inattivo che cicla transitoriamente su e off dal lisosoma. In seguito al digiuno, questo supercomplesso si dissocia. Questa dissociazione è facilitata da Wdr59 e permette a GATOR1 di adottare una conformazione GAP-attiva, in cui la subunità catalitica Nprl2 ingaggia RagA per inibire TORC1. Lo studio evidenzia che, sebbene la logica regolatoria centrale sia conservata tra mammiferi e Drosophila, componenti specifiche come Wdr59 svolgono ruoli sfumati e dipendenti dal contesto nel rimodellamento del complesso GATOR per rispondere allo stress nutritivo.