GATOR2 regulates the nutrient-dependent recruitment of GATOR1 to lysosomes

Résumé technique : GATOR2 régule le recrutement de GATOR1 aux lysosomes en fonction des nutriments

Énoncé du problème
Le complexe Target of Rapamycin 1 (TORC1) est un régulateur central du métabolisme cellulaire, intégrant les signaux provenant des nutriments, des facteurs de croissance et de l'état énergétique. Son activation dépend de son recrutement à la surface lysosomale par les GTPases Rag. Ce recrutement est régi par le complexe GATOR, qui comprend deux sous-complexes : GATOR1, une protéine activatrice de GTPase (GAP) qui inhibe TORC1 en convertissant RagA vers son état inactif lié au GDP pendant la carence, et GATOR2, qui antagonise GATOR1 pour favoriser l'activation de TORC1 dans des conditions riches en nutriments. Bien que les composants structurels de ces complexes soient connus, le mécanisme précis par lequel GATOR2 inhibe l'activité GAP de GATOR1 et la manière dont le statut nutritionnel régule dynamiquement l'assemblage et le recrutement de ces complexes au lysosome dans un organisme multicellulaire restent indéfinis. Plus précisément, il n'est pas clair si les hiérarchies de régulation observées dans les cultures de cellules de tissus mammifères (telles que la nécessité du complexe KICSTOR) sont conservées chez Drosophila, et comment le supercomplexe GATOR1-GATOR2 se comporte dynamiquement en réponse au stress nutritionnel in vivo.

Méthodologie
Pour répondre à ces questions, les auteurs ont développé un arsenal génétique et d'imagerie complet chez Drosophila melanogaster.

1. Marquage génomique : En utilisant CRISPR/Cas9, les auteurs ont généré des lignées de mouches homozygotes viables avec des étiquettes endogènes (par exemple, V5, FLAG, T7, GFP11) sur les composants clés de la voie, incluant les sous-unités de GATOR1 (iml1, nprl2, nprl3), les sous-unités de GATOR2 (mio, wdr24, wdr59) et les GTPases Rag (ragA, ragC). Cela a permis de garantir des niveaux d'expression natifs et d'éviter les artefacts associés à la surexpression.
2. Système Split-GFP : Pour visualiser les protéines endogènes dans des types cellulaires spécifiques sans le bruit de fond des tissus environnants, les auteurs ont employé une stratégie de split-GFP. Les protéines marquées génomiquement ont été fusionnées à la GFP11, tandis que la GFP1-10 était exprimée sous des drivers spécifiques aux tissus (par exemple, nos-Gal4 pour la lignée germinale, slbo-Gal4 pour les cellules frontières). La reconstitution du signal GFP a permis une localisation subcellulaire à haute résolution.
3. Génétique de perte de fonction : Les auteurs ont généré des clones mutants homozygotes nuls dans la lignée germinale pour diverses composantes de la voie afin d'évaluer la dépendance du recrutement lysosomal entre GATOR1, GATOR2 et les GTPases Rag.
4. Essais biochimiques : L'immunoprécipitation (IP) suivie de la spectrométrie de masse et du Western blot a été utilisée pour analyser les interactions protéine-protéine et la stabilité des complexes dans des ovaires de type sauvage versus des mutants wdr24 dans des conditions d'alimentation et de jeûne.
5. Recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) : Les auteurs ont réalisé un FRAP lysosomal sur des ovaires entiers cultivés pour mesurer les taux d'échange dynamiques (fractions mobiles) des composants marqués de GATOR1, GATOR2 et des GTPases Rag entre le lysosome et le cytoplasme dans des conditions d'alimentation et de jeûne.
6. Validation inter-espèces : Des expériences de FRAP parallèles ont été menées dans des cellules HeLa transfectées de manière transitoire pour tester la conservation des dynamiques observées dans les systèmes mammifères.

Contributions clés et résultats

• Conservation des hiérarchies de régulation : L'étude confirme que chez Drosophila, la GTPase Rag est requise pour le recrutement lysosomal de GATOR1 et de GATOR2. Inversement, GATOR1 et GATOR2 sont mutuellement dépendants pour leur localisation lysosomale. Notamment, les auteurs ont découvert que Drosophila ne possède pas d'homologues du complexe KICSTOR (requis pour le recrutement de GATOR1 chez les mammifères), pourtant la logique de recrutement centrale reste conservée.
• GATOR2 maintient GATOR1 dans un état inactif : L'analyse biochimique a révélé qu'en l'absence de GATOR2 (spécifiquement dans les mutants wdr24), l'association entre la sous-unité catalytique de GATOR1 (Nprl2) et la sous-unité inhibitrice (Iml1/DEPDC5) est significativement réduite. Dans les conditions de type sauvage, GATOR2 favorise une association à haute affinité entre Iml1 et l'hétérodimère Nprl2/Nprl3. Cela suggère que GATOR2 stabilise GATOR1 dans une conformation GAP-inactive où Iml1 se lie à RagA, empêchant l'hydrolyse du GTP.
• Découplage du supercomplexe dépendant des nutriments : L'analyse FRAP a fourni des preuves dynamiques que GATOR1 et GATOR2 fonctionnent comme un supercomplexe dans des conditions riches en nutriments, présentant des taux d'échange lysosomaux similaires. Cependant, lors de la carence, leurs comportements divergent :
  • GATOR1 : La fraction mobile des composants de GATOR1 (Nprl2, Iml1) diminue significativement, indiquant qu'ils deviennent plus étroitement associés au lysosome (ou moins échangeables), ce qui est cohérent avec la transition vers un état GAP-actif qui engage RagA-GTP.
  • GATOR2 : En revanche, la fraction mobile des composants clés de GATOR2 (Mio, Wdr24) augmente lors de la carence, suggérant une dissociation du supercomplexe lysosomal.
• Le rôle unique de Wdr59 : L'étude identifie Wdr59 comme un régulateur critique qui ne se comporte pas comme un composant central de GATOR2. Dans les conditions d'alimentation, la dynamique de Wdr59 reflète le supercomplexe GATOR1-GATOR2. Cependant, lors de la carence, la dynamique de Wdr59 change pour ressembler à celle de GATOR1 (mobilité réduite) plutôt qu'à celle de GATOR2. De plus, dans les mutants wdr59, le découplage induit par la carence de GATOR1 et GATOR2 est aboli ; le recrutement lysosomal de GATOR1 ne change plus selon le statut nutritionnel. Cela suggère que Wdr59 est nécessaire pour lever l'inhibition médiée par GATOR2 et faciliter la transition de GATOR1 vers son état actif.
• Conservation chez les mammifères : Les expériences de FRAP dans les cellules HeLa ont récapitulé les résultats de Drosophila : la carence a diminué le recrutement lysosomal du composant de GATOR1 NPRL2 tandis qu'elle a augmenté le recrutement du composant de GATOR2 WDR24, et WDR59 s'est comporté de manière similaire à GATOR1.

Signification
Cet article établit un outil in vivo polyvalent pour disséquer la régulation de TORC1 aux niveaux cellulaire unique et subcellulaire chez Drosophila. Les auteurs proposent un modèle raffiné pour la régulation de GATOR : dans des conditions riches en nutriments, GATOR2 stabilise GATOR1 dans un supercomplexe GAP-inactif qui cycle de manière transitoire sur et hors du lysosome. Lors de la carence nutritionnelle, ce supercomplexe se dissocie. Cette dissociation est facilitée par Wdr59 et permet à GATOR1 d'adopter une conformation GAP-active, où la sous-unité catalytique Nprl2 engage RagA pour inhiber TORC1. L'étude souligne que bien que la logique de régulation centrale soit conservée entre les mammifères et Drosophila, des composants spécifiques comme Wdr59 jouent des rôles nuancés et dépendants du contexte dans le remodelage du complexe GATOR pour répondre au stress nutritionnel.