GATOR2 regulates the nutrient-dependent recruitment of GATOR1 to lysosomes

Resumen Técnico: GATOR2 regula el reclutamiento de GATOR1 a los lisosomas dependiente de nutrientes

Planteamiento del problema
El Complejo 1 de la diana de rapamicina (TORC1) es un regulador central del metabolismo celular, que integra señales de nutrientes, factores de crecimiento y el estado energético. Su activación depende de su reclutamiento a la superficie lisosomal mediante las GTPasas Rag. Este reclutamiento está gobernado por el complejo GATOR, que comprende dos subcomplejos: GATOR1, una proteína activadora de la GTPasa (GAP) que inhibe a TORC1 al convertir a RagA al estado inactivo unido a GDP durante la inanición, y GATOR2, que antagoniza a GATOR1 para promover la activación de TORC1 en condiciones de abundancia de nutrientes. Si bien los componentes estructurales de estos complejos son conocidos, el mecanismo preciso por el cual GATOR2 inhibe la actividad GAP de GATOR1 y cómo el estado de los nutrientes regula dinámicamente el ensamblaje y el reclutamiento de estos complejos al lisosoma en un organismo multicelular aún no se ha definido. Específicamente, no está claro si las jerarquías regulatorias observadas en células de cultivo de tejido mamífero (como la necesidad del complejo KICSTOR) se conservan en Drosophila, y cómo se comporta el supercomplejo GATOR1-GATOR2 dinámicamente en respuesta al estrés por nutrientes in vivo.

Metodología
Para abordar estas cuestiones, los autores desarrollaron un conjunto de herramientas genéticas y de imagen integral en Drosophila melanogaster.

1. Etiquetado genómico: Utilizando CRISPR/Cas9, los autores generaron líneas de moscas viables homocigotas con etiquetas endógenas (p. ej., V5, FLAG, T7, GFP11) en componentes clave de la vía, incluyendo subunidades de GATOR1 (iml1, nprl2, nprl3), subunidades de GATOR2 (mio, wdr24, wdr59) y GTPasas Rag (ragA, ragC). Esto aseguró niveles de expresión nativos y evitó artefactos asociados a la sobreexpresión.
2. Sistema de la proteína fluorescente dividida (Split-GFP): Para visualizar proteínas endógenas en tipos celulares específicos sin el ruido de fondo de los tejidos circundantes, los autores emplearon una estrategia de split-GFP, fusionando las proteínas etiquetadas genómicamente con GFP11, mientras que el GFP1-10 se expresó bajo promotores específicos de tejido (p. ej., nos-Gal4 para la línea germinal, slbo-Gal4 para las células de frontera). La reconstitución de la señal de GFP permitió la localización subcelular de alta resolución.
3. Genética de pérdida de función: Los autores generaron clones mutantes homocigotos nulos en la línea germinal para varios componentes de la vía con el fin de evaluar la dependencia del reclutamiento lisosomal entre GATOR1, GATOR2 y las GTPasas Rag.
4. Ensayos bioquímicos: Se utilizaron inmunoprecipitación (IP) seguida de espectrometría de masas y Western blot para analizar las interacciones proteína-proteína y la estabilidad de los complejos en ovarios de tipo silvestre frente a mutantes wdr24 en condiciones de alimentación y de inanición.
5. Recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP): Los autores realizaron FRAP lisosomal en ovarios cultivados enteros para medir las tasas de intercambio dinámico (fracciones móviles) de los componentes de GATOR1, GATOR2 y las GTPasas Rag entre el lisosoma y el citoplasma en condiciones de alimentación e inanición.
6. Validación entre especies: Se realizaron experimentos de FRAP paralelos en células HeLa transfectadas transitoriamente para probar la conservación de la dinámica observada en sistemas de mamíferos.

Contribuciones clave y resultados

• Conservación de las jerarquías regulatorias: El estudio confirma que en Drosophila, la GTPasa Rag es necesaria para el reclutamiento lisosomal tanto de GATOR1 como de GATOR2. Por el contrario, GATOR1 y GATOR2 son mutuamente dependientes para su localización lisosomal. Notablemente, los autores encontraron que Drosophila carece de homólogos del complejo KICSTOR (requerido para el reclutamiento de GATOR1 en mamíferos), pero la lógica central de reclutamiento permanece conservada.
• GATOR2 mantiene a GATOR1 en un estado inactivo: El análisis bioquímico reveló que en ausencia de GATOR2 (específicamente en mutantes wdr24), la asociación entre la subunidad catalítica de GATOR1 (Nprl2) y la subunidad inhibitoria (Iml1/DEPDC5) se reduce significamente. En condiciones de tipo silvestre, GATOR2 promueve una asociación de alta afinidad entre Iml1 y el heterodímero Nprl2/Nprl3. Esto sugiere que GATOR2 estabiliza a GATOR1 en una conformación con baja actividad GAP donde Iml1 se une a RagA, previniendo la hidrólisis de GTP.
• Desacoplamiento del supercomplejo dependiente de nutrientes: El análisis de FRAP proporcionó evidencia dinámica de que GATOR1 y GATOR2 funcionan como un supercomplejo en condiciones de abundancia de nutrientes, exhibiendo tasas de intercambio lisosomal similares. Sin embargo, ante la inanición, sus comportamientos divergen:
  • GATOR1: La fracción móvil de los componentes de GATOR1 (Nprl2, Iml1) disminuye significativamente, lo que indica que se asocian de forma más estable al lisosoma (o son menos intercambiables), lo cual es consistente con la transición a un estado con actividad GAP que interactúa con RagA-GTP.
  • GATOR2: Por el contrario, la fracción móvil de los componentes centrales de GATOR2 (Mio, Wdr24) aumenta tras la inanición, lo que sugiere una disociación del supercomplejo de GATOR1 en el lisosoma.
• El papel único de Wdr59: El estudio identifica a Wdr59 como un regulador crítico que no se comporta como un componente central de GATOR2. En condiciones de alimentación, la dinámica de Wdr59 refleja la del supercomplejo GATOR1-GATOR2. Sin embargo, tras la inanición, la dinámica de Wdr59 cambia para asemejarse a la de GATOR1 (reducción de la movilidad) en lugar de la de GATOR2. Además, en mutantes wdr59, el desacoplamiento de GATOR1 y GATOR2 inducido por la inanición se anula; GATOR1 permanece en un estado donde su reclutamiento lisosomal no cambia con el estado nutricional. Esto sugiere que Wdr59 es necesario para aliviar la inhibición mediada por GATOR2 y facilitar la transición de GATOR1 hacia su estado activo.
• Conservación en mamíferos: Los experimentos de FRAP en células HeLa recapitularon los hallazgos de Drosophila: la inanición disminuyó el reclutamiento lisosomal del componente de GATOR1, NPRL2, mientras que aumentó el reclutamiento del componente de GATOR2, WDR24, y WDR59 se comportó de manera similar a GATOR1.

Significancia
Este artículo establece un kit de herramientas in vivo versátil para diseccionar la regulación de TORC1 a niveles celulares únicos y subcelulares en Drosophila. Los autores proponen un modelo refinado para la regulación de GATOR: bajo condiciones de abundancia de nutrientes, GATOR2 estabiliza a GATOR1 en un supercomplejo con baja actividad GAP que circula transitoriamente dentro y fuera del lisosoma. Tras la inanición de nutrientes, este supercomplejo se disocia. Esta disociación es facilitada por Wdr59 y permite que GATOR1 adopte una conformación con actividad GAP, donde la subunidad catalítica Nprl2 interactúa con RagA para inhibir a TORC1. El estudio destaca que, si bien la lógica regulatoria central se conserva entre mamíferos y Drosophila, componentes específicos como Wdr59 desempeñan roles matizados y dependientes del contexto en la remodelación del complejo GATOR para responder al estrés por nutrientes.