GATOR2 regulates the nutrient-dependent recruitment of GATOR1 to lysosomes

기술 요약: GATOR2는 영양분 의존적인 GATOR1의 리소좀 모집을 조절한다

문제 제기
Target of Rapamycin 복합체 1(TORC1)은 세포 대사의 중심적인 조절자로, 영양분, 성장 인자 및 에너지 상태로부터 오는 신호를 통합한다. TORC1의 활성화는 Rag GTPase에 의한 리소좀 표면으로의 모집에 달려 있다. 이 모집은 GATOR 복합체에 의해 제어되는데, 이 복합체는 두 개의 하위 복합체로 구성된다: GATOR1은 기질인 GTPase-활성 단백질(GAP)로서, 기아 상태 동안 RagA를 불활성 상태인 GDP 결합 상태로 전환하여 TORC1을 억제하며, GATOR2는 영양분이 풍부한 조건에서 TORC1 활성화를 촉진하기 위해 GATOR1을 길항한다. 이러한 복합체들의 구조적 성분은 알려져 있으나, GATOR2가 GATOR1의 GAP 활성을 어떻게 억제하는지에 대한 정확한 메커니즘과, 영양 상태가 다세포 생물 내에서 이러한 복합체의 조립 및 모집을 어떻게 동적으로 조절하는지는 아직 정의되지 않았다. 특히, 포유류 조직 배양 세포에서 관찰되는 조절 계층 구조(예: KICSTOR 복합체의 필요성)가 Drosophila(초파리)에서도 보존되는지 여부가 불분데하며, GATOR1-GATOR2 슈퍼복합체가 영양 스트레스에 반응하여 체내(in vivo)에서 어떻게 동적으로 행동하는지도 불분명하다.

방법론
이러한 질문들을 해결하기 위해, 저자들은 Drosophila melanogaster(초파리)를 이용한 포괄적인 유전 및 이미징 툴킷을 개발하였다.

1. 게놈 태깅(Genomic Tagging): CRISPR/Cas9을 사용하여, 저자들은 GATOR1 하위 단위(iml1, nprl2, nprl3), GATOR2 하위 단위(mio, wdr24, wdr59), 그리고 Rag GTPase(ragA, ragC)를 포함한 주요 경로 성분에 엔도제너스 태그(예: V5, FLAG, T7, GFP11)를 부착한 동형 접합 생존 형질 전환 초파리 라인을 생성하였다. 이는 천연 발현 수준을 보장하고 과발현으로 인한 인위적 효과를 방지하였다.
2. Split-GFP 시스템: 주변 조직으로부터의 배경 신호 없이 특정 세포 유형에서 엔도제너스 단백질을 시각화하기 위해, 저자들은 split-GFP 전략을 채택하였다. 게놈 태깅된 단백질은 GFP11에 융합되었고, GFP1-10은 조직 특이적 드라이버(예: 생식선을 위한 nos-Gal4, 경계 세포를 위한 slbo-Gal4)에 의해 발현되었다. GFP1-10의 재구성(reconstitution)을 통해 고해상도 아세포 소기관 국소화(subcellular localization)를 구현하였다.
3. 결손 기능 유전학(Loss-of-Function Genetics): 저자들은 GATOR1, GATOR2 및 Rag GTPase 간의 리소좀 모집 의존성을 평가하기 위해 생식계 내의 다양한 경로 성분에 대한 동형 접합 null 돌연변이 클론을 생성하였다.
4. 생화학적 분석: 단백-단백 상호작용 및 복합체 안정성을 영양 공급 상태와 기아 상태의 야생형 및 wdr24 돌연변이 난소에서 분석하기 위해 면역침강(IP) 후 질량 분석법 및 웨스턴 블로팅을 사용하였다.
5. 광퇴색 후 형광 회복(FRAP): 저자들은 전체 배양 난소를 대상으로 리소좀 FRAP을 수행하여, 영양 공급 및 기아 조건 하에서 태깅된 GATOR1, GATOR2 및 Rag GTPase 성분들의 동적 교환율(이동 분율, mobile fractions)을 측정하였다.
6. 교차 종 검증(Cross-Species Validation): 관찰된 역학이 포유류 시스템에서도 보존되는지 테스트하기 위해, 일시적 형질 전환된 HeLa 세포에서 병행 FRAP 실험을 수행하였다.

주요 기여 및 결과

• 조절 계층의 보존: 본 연구는 Drosophila에서 Rag GTPase가 GATOR1과 GATOR2 모두의 리소좀 모집에 필요함을 확인하였다. 반대로, GATOR1과 GATOR2는 리소좀 국소화를 위해 상호 의존적이다. 주목할 점은, Drosophila에는 (포유류에서 GATOR1 모집에 필요한) KICSTOR 복합체의 상동체가 없으나, 핵심적인 모집 논리는 보존되어 있다는 것이다.
• GATOR2는 GATOR1을 불활성 상태로 유지함: 생화학적 분석 결과, GATOR2가 없는 경우(특히 wdr24 돌연변이에서), GATOR1의 촉매 하위 단위(Nprl2)와 억제 하위 단위(Iml1/DEPDC5) 사이의 결합이 크게 감소함이 밝혀졌다. 야생형 조건에서 GATOR2는 Iml1과 Nprl2/Nprl3 이합체 사이의 높은 친화력 결합을 촉진한다. 이는 GATOR2가 GATOR1을 Iml1이 RagA에 결합하여 GTP 가수분해를 방지하는 GAP-불활성 형태(GAP-inactive conformation)로 안정화시킨다는 것을 시사한다.
• 영양분 의존적 슈퍼복합체의 디커플링(Decoupling): FRAP 분석은 영양분이 풍부한 조건에서 GATOR1과 GATOR2가 유사한 리소좀 교환율을 보이며 하나의 슈퍼복합체로서 기능한다는 동적 증거를 제공하였다. 그러나 기아 상태가 되면 이들의 행동은 갈라진다:
  • GATOR1: GATOR1 성분(Nprl2, Iml1)의 이동 분율이 유의하게 감소하였는데, 이는 이들이 리소좀과 더 안정적으로 결합되어 있거나(또는 교환이 덜 용이함) 있음을 나타내며, 이는 RagA-GTP와 결합하는 GAP-활성 상태로의 전이와 일치한다.
  • GATOR2: 반면, 핵심 GATOR2 성분(Mio, Wdr24)의 이동 분율은 기아 시 증가하였으며, 이는 리소좀 슈퍼복합체로부터 해리됨을 시사한다.
• Wdr59의 독특한 역할: 본 연구는 Wdr59이 핵심 GATOR2 성분과는 다르게 행동하는 중요한 조절자임을 식별하였다. 영양 공급 조건에서 Wdr59의 역학은 GATOR1-GATOR2 슈퍼복합체와 유사하다. 그러나 기아 시, Wdr59의 역학은 GATOR2가 아닌 GATOR1(감소된 이동성)과 유사한 양상을 보인다. 또한, wdr59 돌연변이에서는 GATOR1과 GATOR2의 기아 유도 디커플링이 소멸되어, GATOR1이 영양 상태에 따라 리소좀 모집이 변하지 않는 상태로 남게 된다. 이는 Wdr59이 GATOR2 매개 억제를 완화하고 GATOR1이 활성 상태로 전이되는 것을 돕는 데 필요함을 시사한다.
• 포유류에서의 보존: HeLa 세포에서의 FRAP 실험은 Drosophila의 결과를 재현하였다: 기아는 GATOR1 성분인 NPRL2의 리소좀 모집을 감소시킨 반면, GATOR2 성분인 WDR24의 모집을 증가시켰으며, WDR59은 GATOR1과 유사하게 행동하였다.

의의
본 논문은 Drosophila를 이용하여 단일 세포 및 아세포 소기관 수준에서 TORC1 조절을 해부할 수 있는 다각적인 체내(in vivo) 툴킷을 확립하였다. 저자들은 정교해진 GATOR 조절 모델을 제시한다: 영양분이 풍-부한 조건에서, GATOR2는 GATOR1을 리소좀을 일시적으로 순환하는 GAP-불활성 슈퍼복합체 상태로 안정화시킨다. 영양 결핍 시, 이 슈퍼복합체는 해리된다. 이 해리는 Wdr59에 의해 촉진되며, 이를 통해 GATOR1이 GAP-활성 형태를 취하여 촉매 하위 단위인 Nprl2가 RagA와 결합하여 TORC1을 억제할 수 있게 한다. 이 연구는 핵심적인 조절 논리는 포유류와 Drosophila 사이에 보존되어 있지만, Wdr59과 같은 특정 성분들이 영양 스트레스에 대응하여 GATOR 복합체를 재구조화하는 데 있어 미묘하고 맥락 의존적인 역할을 수행한다는 점을 강조한다.