A rational design strategy and validation for protease-resistant fusion-inhibitor antiviral peptides

I virus che si avvolgono in una membrana grassa, noti come virus rivestiti, devono fondere il proprio strato esterno con una cellula umana per causare un'infezione. Per farlo, utilizzano una chiave molecolare chiamata proteina spike, che subisce un drammatico cambiamento di forma per bloccare insieme il virus e la cellula. Gli scienziati sanno da tempo che potrebbero potenzialmente fermare questo processo creando un esca: un breve pezzo di proteina che imita una parte della chiave stessa del virus. Questa esca si legherebbe alla proteina spike, bloccando il meccanismo e impedendo al virus di entrare nella cellula. Sebbene questa strategia funzioni bene in una provetta, storicamente è fallita come farmaco perché il corpo umano è pieno di enzimi che agiscono come forbici molecolari, tritando queste proteine esca prima che possano svolgere il loro compito.

Un team di ricercatori ha ora trovato un modo per superare queste forbici. Hanno scoperto che l'enzima stesso che il virus usa per sbloccare le cellule è anche quello che distrugge le proteine esca. Studiando i punti specifici in cui questo enzima taglia, hanno riprogettato le proteine esca affinché fossero invisibili alle forbici pur mantenendo la loro capacità di bloccare la serratura virale. Testata in cellule viventi e nei topi, queste nuove esche, più resistenti, sono rimaste attive molto più a lungo delle versioni originali, offrendo una strada promettente verso un trattamento preventivo sicuro che potrebbe essere somministrato prima che una persona venga esposta al virus.

La storia inizia con un tipo specifico di virus, il SARS-CoV-2, che causa il COVID-19. Come molti altri virus, esso si affida a una proteina spike per violare le difese delle cellule umane. All'interno del virus, c'è una regione chiamata ripetizione euristica 2, o HR2, che è cruciale per il processo di fusione. In passato, gli scienziati hanno tentato di utilizzare un breve pezzo di questa regione HR2 come farmaco. L'idea era che questo pezzo sarebbe rimasto in sospensione e si sarebbe legato alla regione HR2 del proprio virus, legandogli di fatto le mani per impedirgli di fondersi con la cellula. Tuttavia, nel corpo, questi brevi pezzi di proteina sono fragili. I ricercatori sospettavano che un enzima specifico nelle vie respiratorie umane, chiamato TMPRSS2, fosse responsabile della distruzione delle proteine esca. Questo enzima è essenziale affinché il virus entri nelle cellule, poiché taglia la proteina spike per attivarla. Il team ipotizzò che questo stesso enzima stesse anche tagliando le proteine esca terapeutiche, rendendole inutili.

Per testare questo, i ricercatori hanno preso le proteine esca originali e le hanno esposte all'enzima TMPRSS2 in una capsula di laboratorio. Entro un'ora, l'enzima aveva completamente affettato le esche in pezzi. Quando hanno testato questi frammenti sminuzzati in un esperimento di fusione cellulare, hanno scoperto che i frammenti avevano perso ogni capacità di fermare il virus. Ciò ha confermato che l'enzima era effettivamente il colpevole del fallimento delle esche. Il passo successivo era scoprire esattamente dove l'enzima tagliava. Utilizzando una tecnica che identifica la composizione chimica delle molecole, hanno individuato tre punti specifici sulle proteine esca dove l'enzima effettuava i suoi tagli. Questi punti erano ricchi di componenti fondamentali delle proteine, che l'enzima prende di mira specificamente.

Armati di questa conoscenza, il team si è messo a riprogettare le esche. Dovevano cambiare i tre punti di taglio in modo che l'enzima non li riconoscesse più, ma dovevano fare attenzione a non cambiare la forma dell'esca così tanto da non poter più legarsi al virus. Per risolvere il problema, hanno utilizzato due diverse strategie per trovare i sostituti migliori. Per prima cosa, hanno creato una vasta libreria di milioni di versioni leggermente diverse delle esche e hanno testato quali si legassero ancora saldamente al bersaglio del virus. In secondo luogo, hanno esaminato i record genetici delle varianti di SARS-CoV-2 trovate in natura per vedere quali cambiamenti erano già avvenuti senza rompere il virus. Combinando questi due approcci, hanno identificato tre nuove versioni della proteina esca che erano resistenti all'enzima ma ancora efficaci nel legarsi.

I ricercatori hanno poi sintetizzato queste tre nuove proteine e le hanno testate. Hanno confermato che l'enzima non poteva più tagliarle. Negli esperimenti cellulari, tutte e tre le nuove esche hanno interrotto con successo la fusione del virus con le cellule, anche in presenza dell'enzima. Una versione, che i ricercatori hanno chiamato HR2-NHN, è stata quella con le prestazioni migliori. Per capire perché questa specifica versione funzionasse così bene, il team ha utilizzato una potente tecnica di imaging chiamata criomicroscopia elettronica per scattare una foto 3D dettagliata dell'esca legata al suo bersaglio. Hanno scoperto che, mentre uno dei cambiamenti apportati rimuoveva una forte attrazione elettrica tra l'esca e il virus, creava una nuova connessione stabile che li teneva uniti con la stessa forza. Questa intuizione strutturale ha spiegato perché la nuova esca fosse così potente.

La vera prova è arrivata quando i ricercatori sono passati dalle capsule cellulari agli animali viventi. Hanno utilizzato topi suscettibili a una variante di SARS-CoV-2. In questi esperimenti, hanno somministrato l'esca originale e la nuova, più resistente HR2-NHN a tempi diversi prima di infettare i topi con il virus. Quando somministrata poco prima dell'infezione, entrambe le versioni funzionavano bene. Tuttavia, quando i ricercatori hanno aspettato dodici ore prima di infettare i topi, l'esca originale aveva perso la maggior parte del suo potere. La nuova HR2-NHN, al contrario, rimaneva altamente efficace. Ha continuato a proteggere i topi anche quando somministrata un giorno intero prima dell'introduzione del virus. In un esperimento separato, hanno misurato quanto tempo le esche rimanessero attive nei polmoni dei topi. L'effetto protettivo dell'esca originale svaniva con un'emivita di circa otto ore, mentre la nuova esca durava undici ore. Questa differenza significava che la nuova esca poteva prevenire l'infezione per una finestra temporale significativamente più lunga.

Lo studio ha anche esaminato come queste esche si comportassero contro diversi ceppi del virus, incluso il variante Omicron. Sebbene la nuova esca fosse leggermente meno efficace contro Omicron rispetto al ceppo originale, superava comunque la vecchia esca. I ricercatori hanno notato che i cambiamenti apportati all'esca potrebbero aiutarla a entrare nelle cellule in modo più efficiente o a resistere ad altri enzimi presenti all'interno della cellula, il che potrebbe spiegare questa ulteriore resilienza. Il lavoro dimostra che è possibile creare un antivirale a base proteica che non richieda complesse modifiche chimiche per sopravvivere nel corpo. Semplicemente cambiando alcune lettere nel codice della proteina per evitare le forbici naturali del corpo, i ricercatori hanno creato un candidato farmaco che è più stabile e duraturo.

Questo approccio offre un nuovo modo di pensare alla lotta contro le infezioni virali. Invece di fare affidamento su costosi rivestimenti chimici per proteggere un farmaco, gli scienziati possono ora usare le debolezze del virus stesso e l'ambiente naturale del corpo per progettare medicinali migliori. Il successo di questa strategia con SARS-CoV-2 suggerisce che potrebbe essere applicata ad altri virus pericolosi che utilizzano meccanismi di fusione simili, come Ebola, Nipah e HIV. I ricercatori immaginano un futuro in cui uno spray nasale semplice contenente queste proteine riprogettate possa essere usato come misura preventiva, proteggendo le persone prima che siano esposte a un virus o aiutando a fermare un'infezione nelle sue fasi iniziali. Le scoperte forniscono un modello chiaro e pratico per trasformare fragili frammenti proteici in strumenti robusti e salvavita.