A rational design strategy and validation for protease-resistant fusion-inhibitor antiviral peptides

Vírus que se envolvem em uma membrana gordurosa, conhecidos como vírus envelopados, devem fundir sua camada externa com uma célula humana para causar uma infecção. Para fazer isso, eles usam uma chave molecular chamada proteína de espícula (spike), que sofre uma mudança drástica de forma para travar o vírus e a célula juntos. Cientistas sabem há muito tempo que poderiam potencialmente interromper esse processo criando um chamariz: um pequeno pedaço de proteína que imita parte da própria chave do vírus. Esse chamariz se ligaria à proteína de espícula, travando o mecanismo e impedindo o vírus de entrar na célula. Embora essa estratégia funcione bem em um tubo de ensaio, ela historicamente falhou como medicamento porque o corpo humano é cheio de enzimas que agem como tesouras moleculares, retalhando esses decoys proteicos antes que possam realizar seu trabalho.

Uma equipe de pesquisadores agora encontrou uma maneira de enganar essas tesouras. Eles descobriram que a própria enzima que o vírus usa para destravar as células é também a que destrói os decoys proteicos. Ao estudar os locais específicos onde essa enzima corta, eles redesenharam os decoys proteicos para serem invisíveis às tesouras, mantendo sua capacidade de travar o bloqueio viral. Ao serem testados em células vivas e em camundongos, esses novos decoys mais resistentes permaneceram ativos por muito mais tempo do que as versões originais, oferecendo um caminho promissor para um tratamento preventivo seguro que poderia ser administrado antes de uma pessoa ser exposta ao vírus.

A história começa com um tipo específico de vírus, o SARS-CoV-2, que causa a COVID-19. Como muitos outros vírus, ele depende de uma proteína de espícula para romper as defesas das células humanas. Dentro do vírus, existe uma região chamada repetição heptante 2, ou HR2, que é crucial para o processo de fusão. Cientistas tentaram anteriormente usar um pequeno pedaço desta região HR2 como um fármaco. A ideia era que este pedaço flutuaria e se ligaria à própria região HR2 do vírus, efetivamente amarrando suas mãos para que ele não pudesse se fundir com a célula. No entanto, no corpo, esses pequenos pedaços de proteína são frágeis. Os pesquisadores suspeitaram que uma enzima específica nas vias aéreas humanas, chamada TMPRSS2, era responsável por destruir os decoys proteicos. Esta enzima é essencial para o vírus entrar nas células, pois corta a proteína de espícula para ativá-la. A equipe hipotetizou que esta mesma enzima também estava cortando os decoys terapêuticos, tornando-os inúteis.

Para testar isso, os pesquisadores pegaram os decoys proteicos originais e os expuseram à enzima TMPRSS2 em uma placa de laboratório. Em menos de uma hora, a enzima havia completamente fatiado os decoys em pedaços. Quando testaram esses fragmentos cortados em um experimento de fusão celular, descobriram que os fragmentos haviam perdido toda a capacidade de deter o vírus. Isso confirmou que a enzima era, de fato, a culpada pelo fracasso dos decoys. O próximo passo foi descobrir exatamente onde a enzima estava cortando. Usando uma técnica que identifica a composição química de moléculas, eles localizaram três pontos específicos nos decoys proteicos onde a enzima realizava seus cortes. Esses pontos eram ricos em blocos de construção básicos de proteínas, que a enzima visa especificamente.

Armados com esse conhecimento, a equipe partiu para redesenhar os decoys. Eles precisavam alterar os três pontos de corte para que a enzima não os reconhecesse mais, mas tinham que ter cuidado para não alterar a forma do decoy a ponto de ele não conseguir mais se ligar ao vírus. Para resolver isso, utilizaram duas estratégias diferentes para encontrar as melhores substituições. Primeiro, criaram uma biblioteca massiva de milhões de versões ligeiramente diferentes de decoys e testaram quais ainda se ligavam fortemente ao alvo do vírus. Segundo, analisaram os registros genéticos de variantes do SARS-CoV-2 encontradas na natureza para ver quais mudanças já haviam ocorrido sem quebrar o vírus. Combinando essas duas abordagens, identificaram três novas versões da proteína decoy que eram resistentes à enzima, mas ainda eficazes na ligação.

Os pesquisadores então sintetizaram essas três novas proteínas e as testaram. Eles confirmaram que a enzima não conseguia mais cortá-las. Em experimentos celulares, todos os três novos decoys interromperam com sucesso a fusão do vírus com as células, mesmo na presença da enzima. Uma versão, que os pesquisadores nomearam como HR2-NHN, teve o melhor desempenho. Para entender por que essa versão específica funcionou tão bem, a equipe utilizou uma poderosa técnica de imagem chamada criomicroscopia eletrônica para tirar uma foto 3D detalhada do decoy ligado ao seu alvo. Eles descobriram que, embora uma das mudanças feitas tenha removido uma forte atração elétrica entre o decoy e o vírus, ela criou uma nova conexão estável que os mantinha unidos com a mesma força. Essa visão estrutural explicou por que o novo decoy era tão potente.

O verdadeiro teste ocorreu quando os pesquisadores passaram de placas de células para animais vivos. Eles utilizaram camundongos suscetíveis a uma variante do SARS-CoV-2. Nesses experimentos, administraram o decoy original e o novo e mais resistente HR2-NHN em momentos diferentes antes de infectar os camundongos com o vírus. Quando administrados pouco antes da infecção, ambas as versões funcionaram bem. No entanto, quando os pesquisadores esperaram doze horas antes de infectar os camundongos, o decoy original havia perdido a maior parte de seu poder. O novo HR2-NHN, por outro lado, permaneceu altamente eficaz. Ele continuou a proteger os camundongos mesmo quando administrado um dia inteiro antes da introdução do vírus. Em um experimento separado, eles mediram quanto tempo os decoys permaneciam ativos nos pulmões dos camundongos. O efeito protetor do decoy original desaparecia com uma meia-vida de cerca de oito horas, enquanto o novo decoy durava onze horas. Essa diferença significava que o novo decoy poderia prevenir a infecção por uma janela de tempo significativamente maior.

O estudo também observou como esses decoys se comportavam contra diferentes cepas do vírus, incluindo a variante Ômicron. Embora o novo decoy fosse ligeiramente menos eficaz contra a Ômicron do que contra a cepa original, ele ainda superou o antigo decoy. Os pesquisadores observaram que as mudanças feitas no decoy poderiam ajudá-lo a entrar nas células de forma mais eficiente ou a resistir a outras enzimas encontradas dentro da célula, o que poderia explicar essa resiliência extra. O trabalho demonstra que é possível criar um antiviral baseado em proteínas que não requer modificações químicas complexas para sobreviver no corpo. Simplesmente alterando algumas letras no código da proteína para evitar as tesouras naturais do corpo, os pesquisadores criaram um candidato a fármaco que é mais estável e duradouro.

Esta abordagem oferece uma nova maneira de pensar sobre o combate a infecções virais. Em vez de depender de revestimentos químicos caros para proteger um fármaco, os cientistas agora podem usar as próprias fraquezas do vírus e o ambiente natural do corpo para projetar melhores medicamentos. O sucesso dessa estratégia com o SARS-CoV-2 sugere que ela pode ser aplicada a outros vírus perigosos que utilizam mecanismos de fusão semelhantes, como Ebola, Nipah e HIV. Os pesquisadores vislumbram um futuro onde um spray nasal simples contendo esses decoys redesenhados poderia ser usado como uma medida preventiva, protegendo as pessoas antes de serem expostas a um vírus ou ajudando a deter uma infecção em seus estágios iniciais. As descobertas fornecem um plano prático e claro para transformar fragmentos proteicos frágeis em ferramentas robustas e capazes de salvar vidas.