A rational design strategy and validation for protease-resistant fusion-inhibitor antiviral peptides

Virussen die zichzelf in een vetachtig membraan wikkelen, bekend als omhulde virussen, moeten hun buitenste laag met een menselijke cel laten versmelten om een infectie te veroorzaken. Hiervoor gebruiken ze een moleculaire sleutel genaamd een spike-eiwit, dat een dramatische vormverandering ondergaat om het virus en de cel aan elkaar te vergrendelen. Wetenschappers weten al lang dat ze dit proces potentieel kunnen stoppen door een lokaas te creëren: een kort stukje eiwit dat een deel van de eigen sleutel van het virus nabootst. Dit lokaas zou zich aan het spike-eiwit binden, het mechanisme blokkeren en voorkomen dat het virus de cel binnendringt. Hoewel deze strategie goed werkt in een reageerbuis, is het historisch gezien gefaald als medicijn omdat het menselijk lichaam vol zit met enzymen die werken als moleculaire scharen, die de eiwitlokazen voordat ze hun werk kunnen doen, in stukken hakken.

Een team van onderzoekers heeft nu een manier gevonden om deze scharen te slim af te zijn. Ze ontdekten dat het zeer specifieke enzym dat het virus gebruikt om cellen te ontgrendelen, ook het enzym is dat de decoy-eiwitten vernietigt. Door de specifieke plekken te bestuderen waar dit enzym knipt, hebben ze de decoy-eiwitten herontworpen zodat ze onzichtbaar zijn voor de scharen, terwijl ze nog steeds in staat blijven om het virale slot te blokkeren. Bij tests in levende cellen en in muizen bleven deze nieuwe, sterkere lokazen veel langer actief dan de oorspronkelijke versies, wat een veelbelovend pad biedt naar een veilige, preventieve behandeling die kan worden toegediend voordat iemand wordt blootgesteld aan het virus.

Het verhaal begint met een specifiek type virus, SARS-CoV-2, dat COVID-19 veroorzaakt. Zoals veel andere virussen, vertrouwt het op een spike-eiwit om de verdediging van menselijke cellen te doorbreken. Binnen het virus bevindt zich een regio genaamd heptad repeat 2, of HR2, die cruciaal is voor het fusieproces. Wetenschappers probeerden eerder een kort stukje van deze HR2-regio als medicijn te gebruiken. Het idee was dat dit stukje zou rondzweven en zich zou binden aan de eigen HR2-regio van het virus, waardoor het de handen effectief zou vasthouden zodat het niet met de cel kan versmelten. Echter, in het lichaam zijn deze korte stukjes eiwit fragiel. De onderzoekers vermoedden dat een specifiek enzym in de menselijke luchtwegen, genaamd TMPRSS2, verantwoordelijk was voor het vernietigen van deze decoy-eiwitten. Dit enzym is essentieel voor de toegang van het virus tot cellen, aangezien het het spike-eiwit doorknipt om het te activeren. Het team stelde de hypothese op dat ditzelfde enzym ook de therapeutische decoy-eiwitten doorknipte, waardoor ze nutteloos werden.

Om dit te testen, namen de onderzoekers de oorspronkelijke decoy-eiwitten en stelden deze bloot aan het TMPRSS2-enzym in een laboratoriumschaal. Binnen één uur had het enzym de lokazen volledig in stukken gesneden. Toen ze deze in stukken gehanteerde fragmenten testten in een cel-fusie-experiment, ontdekten ze dat de fragmenten alle bekwaamheid hadden verloren om het virus te stoppen. Dit bevestigde dat het enzym inderdaad de boosdoener was achter het falen van de lokazen. De volgende stap was uitzoeken waar het enzym precies sneed. Met behulp van een techniek die de chemische samenstelling van moleculen identificeert, brachten ze drie specifieke plekken op de decoy-eiwitten in kaart waar het enzym de sneden maakte. Deze plekken waren rijk aan basisbouwstenen van eiwitten, waar het enzym specifiek op mikt.

Gewapend met deze kennis, begon het team met het herontwerpen van de lokazen. Ze moesten de drie snijplekken veranderen zodat het enzym ze niet langer zou herkennen, maar ze moesten voorzichtig zijn dat ze de vorm van de decoy niet zo veel veranderden dat deze niet meer aan het virus kon binden. Om dit op te lossen, gebruikten ze twee verschillende strategieën om de beste vervangingen te vinden. Eerst creëerden ze een enorme bibliotheek van miljoenen lichtelijk verschillende decoy-versies en testten welke nog steeds stevig aan het doelwit van het virus bonden. Ten tweede bekeken ze de genetische records van natuurlijke SARS-CoV-2-varianten om te zien welke veranderingen al waren opgetreden zonder het virus te breken. Door deze twee benaderingen te combineren, identificeerden ze drie nieuwe versies van het decoy-eiwit die resistent waren tegen het enzym maar nog steeds effectief waren bij het binden.

De onderzoekers synthetiseerden vervolgens deze drie nieuwe eiwitten en testten ze. Ze bevestigden dat het enzym de nieuwe versies niet langer kon doorknippen. In cel-experimenten slaagden alle drie de nieuwe lokazen erin het virus succesvol te stoppen bij het fuseren met cellen, zelfs in aanwezigheid van het enzym. Eén versie, die de onderzoekers HR2-NHN noemden, presteerde het best. Om te begrijpen waarom deze specifieke versie zo goed werkte, gebruikten het team een krachtige beeldvormingstechniek genaamd cryo-elektronenmicroscopie om een gedetailleerde 3D-foto te maken van de decoy gebonden aan zijn doelwit. Ze ontdekten dat hoewel een van de wijzigingen die ze aanbrachten een sterke elektrische aantrekking tussen de decoy en het virus wegnam, het een nieuwe, stabiele verbinding creëerde die hen net zo stevig bij elkaar hield. Dit structurele inzicht verklaarde waarom de nieuwe decoy zo potent was.

De echte test kwam toen de onderzoekers de overstap maakten van celplaten naar levende dieren. Ze gebruikten muizen die vatbaar waren voor een variant van SARS-CoV-2. In deze experimenten bestuurden ze de oorspronkelijke decoy en de nieuwe, sterkere HR2-NHN decoy op verschillende tijdstippen voordat ze de muizen met het virus infecteerden. Wanneer ze vlak voor de infectie werden toegediend, werkten beide versies goed. Echter, toen de onderzoekers twaalf uur wachtten voordat ze de muizen infecteerden, had de oorspronkelijke decoy het grootste deel van zijn kracht verloren. De nieuwe HR2-NHN decoy bleef daarentegen zeer effectief. Het bleef de muizen beschermen, zelfs wanneer het een volledige dag voor de introductie van het virus werd toegediend. In een apart experiment maten ze hoe lang de lokazen actief bleven in de longen van de muizen. Het beschermende effect van de oorspronkelijke decoy nam af met een halfwaardetijd van ongeveer acht uur, terwijl de nieuwe decoy elf uur aanhield. Dit verschil betekende dat de nieuwe decoy een aanzienlijk langer tijdsvenster van infectiepreventie bood.

De studie keek ook naar hoe deze lokazen presteerden tegen verschillende stammen van het virus, inclusief de Omicron-variant. Hoewel de nieuwe decoy iets minder effectief was tegen Omicron dan tegen de oorspronkelijke stam, presteerde het nog steeds beter dan de oude decoy. De onderzoekers merkten op dat de wijzigingen die aan de decoy werden aangebracht, het mogelijk efficiënter in cellen kunnen laten binnendringen of het kunnen helpen resistent te zijn tegen andere enzymen die zich in de cel bevinden, wat deze extra veerkracht zou kunnen verklaren. Het werk demonstreert dat het mogelijk is om een eiwitgebaseerd antiviraal middel te creëren dat geen complexe chemische modificaties vereist om in het lichaam te overleven. Door simpelweg een paar letters in de code van het eiwit te veranderen om de natuurlijke scharen van het lichaam te vermijden, creëerden de onderzoekers een kandidaat-medicijn dat stabieler en langduriger is.

Deze aanpak biedt een nieuwe manier om over het bestrijden van virale infecties na te denken. In plaats van te vertrouwen op dure chemische coatings om een medicijn te beschermen, kunnen wetenschappers nu de eigen zwakheden van het virus en de natuurlijke omgeving van het lichaam gebruiken om betere medicijnen te ontwerpen. Het succes van deze strategie met SARS-CoV-2 suggereert dat het kan worden toegepast op andere gevaarlijke virussen die vergelijkbare fusiemechanismen gebruiken, zoals Ebola, Nipah en HIV. De onderzoekers zien een toekomst voor zich waarin een eenvoudige neusspray met deze herontworpen eiwitten kan worden gebruikt als preventieve maatregel, om mensen te beschermen voordat ze aan een virus worden blootgesteld of om een infectie in de beginfase te stoppen. De bevindingen bieden een duidelijk, praktisch blauwdruk om fragiele eiwitfragmenten te transformeren in robuuste, levensreddende instrumenten.