A rational design strategy and validation for protease-resistant fusion-inhibitor antiviral peptides

被一层脂肪膜包裹的病毒（被称为有包膜病毒）必须将其外层与人类细胞融合才能引发感染。为了实现这一点，它们使用一种被称为刺突蛋白的分子钥匙，这种蛋白质会经历剧烈的形状变化，从而将病毒与细胞锁定在一起。科学家们早已知晓，他们可以通过制造一种“诱饵”来潜在地阻止这一过程：即一段模仿病毒自身钥匙部分的短蛋白质。这种诱饵会结合到刺突蛋白上，从而卡住其机制，防止病毒进入细胞。虽然这种策略在试管实验中表现良好，但在历史上作为药物却失败了，因为人体内充满了像“分子剪刀”一样的酶，会在这些蛋白质诱饵发挥作用之前就将其切碎。

一组研究人员现在找到了一种智斗这些“剪刀”的方法。他们发现，病毒用来解锁细胞的正是那把破坏诱饵蛋白质的酶。通过研究该酶切割的具体位点，他们重新设计了诱饵蛋白质，使其对“剪刀”而言变得“隐形”，同时仍保留着卡住病毒锁定的能力。在活细胞和小白鼠实验中，这些更强韧的新型诱饵比原始版本维持活跃的时间更长，为一种可以在人暴露于病毒前使用的安全预防性疗法提供了广阔前景。

故事始于一种特定类型的病毒——引起新冠肺炎（COVID-19）的 SARS-CoV-2。与许多其他病毒一样，它依赖刺突蛋白来突破人类细胞的防御。在病毒内部，有一个被称为七肽重复 2（HR2）的区域，这对于融合过程至关重要。科学家此前曾尝试使用这段 HR2 区域的一段短序列作为药物。其构想是，这段序列会在周围漂浮并结合到病毒自身的 HR2 区域，从而有效地“捆住”病毒的双手的，使其无法与细胞融合。然而，在体内，这些短蛋白质片段非常脆弱。研究人员怀疑，人类呼吸道中一种名为 TMPRSS2 的特定酶是导致它们被破坏的原因。这种酶对病毒进入细胞至关重要，因为它通过切割刺突蛋白来激活病毒。团队假设，正是这种酶也在切割治疗用的诱饵蛋白，使其失效。

为了验证这一点，研究人员在实验室培养皿中将原始诱饵蛋白暴露在 TMPRSS2 酶中。不到一小时，该酶就将诱饵完全切成了碎片。当他们在细胞融合实验中测试这些被切碎的碎片时，发现这些碎片已完全丧失了阻止病毒的能力。这证实了该酶确实是导致诱饵失效的罪魁祸首。下一步是找出酶究竟在哪里进行切割。利用一种可以识别分子化学成分的技术，他们精准定位了诱饵蛋白上被酶切割的三个特定位点。这些位点富含蛋白质的基础构建模块，而该酶专门针对这些模块进行切割。

带着这些知识，团队着手重新设计诱饵。他们需要改变这三个切割位点，使酶不再能识别它们，但又必须小心，不能让诱饵的形状改变得太大，以至于无法再与病毒结合。为了找到最佳替代方案，他们采用了两种不同的策略。首先，他们创建了一个包含数百万种略有差异的诱饵版本的庞大库，并测试哪些版本仍能与病毒目标紧密结合。其次，他们查阅了自然界中发现的 SARS-CoV-2 变异株的遗传记录，观察哪些变化已经在没有破坏病毒功能的情况下发生过。通过结合这两种方法，他们确定了三个既能抵抗酶类攻击、又能有效结合的新型诱饵蛋白版本。

随后，研究人员合成并测试了这三种新蛋白。他们确认该酶不再能切割它们。在细胞实验中，所有三种新型诱饵都成功阻止了病毒与细胞的融合，即使在存在该酶的情况下也是如此。其中一个版本被研究人员命名为 HR2-NHN，其表现最为出色。为了理解为什么这个特定版本效果如此之好，团队使用了名为冷冻电子显微镜的高级成像技术，拍摄了诱饵与目标结合的详细 3D 图像。他们发现，虽然他们所做的其中一项改变消除了诱饵与病毒之间的一种强电荷吸引力，但也创造了一种新的、稳定的连接，使两者结合得同样紧密。这种结构性的洞察解释了为什么这种新型诱饵如此高效。

真正的考验出现在研究人员从培养皿转向活体动物实验时。他们使用了对 SARS-CoV-2 变异株易感的实验小鼠。在这些实验中，研究人员在感染小鼠前，分别在不同时间点给予了原始诱饵和新型、更强韧的 HR2-NHN 诱饵。当在感染前立即给药时，两个版本都表现良好。然而，当研究人员在感染小鼠前等待了 12 小时后，原始诱饵的大部分效力已经丧失。相比之下，新型的 HR2-NHN 诱饵依然保持高度有效。即使在引入病毒前整整一天后给药，它仍能持续保护小鼠。在另一项实验中，他们测量了诱饵在小鼠肺部保持活跃的时间。原始诱饵的保护效应半衰期约为 8 小时，而新型诱饵则能维持 11 小时。这意味着新型诱饵可以显著延长预防感染的时间窗口。

研究还观察了这些诱饵在包括 Omicron 变异株在内的不同病毒株中的表现。虽然新型诱饵在应对 Omicron 时比应对原始毒株时的效率略低，但它仍然优于旧版诱饵。研究人员指出，对诱饵进行的修改可能有助于其更有效地进入细胞或抵抗细胞内发现的其他酶，这解释了其额外的韧性。这项工作证明，通过不需要复杂的化学修饰即可在体内生存的蛋白质类抗病毒药物是完全可以实现的。通过仅仅改变蛋白质代码中的几个字母来避开体内的“天然剪刀”，研究人员创造出了一种更稳定、更持久的候选药物。

这种方法为对抗病毒感染提供了一种全新的思考方式。科学家们现在不必依赖昂贵的化学涂层来保护药物，而是可以利用病毒自身的弱点以及人体的自然环境来设计更好的药物。这种策略在 SARS-CoV-2 上的成功表明，它可以应用于其他使用类似融合机制的危险病毒，如埃博拉病毒、尼帕病毒和 HIV。研究人员设想，未来可以使用含有这些重新设计的蛋白质的简单鼻喷剂作为预防措施，在人们接触病毒前进行保护，或者帮助在感染初期遏制病情。这些发现为将脆弱的蛋白质片段转化为强大且救命的工具提供了一个清晰、实用的蓝图。