Epi-PoreC: a nanopore-based method for simultaneous profiling of chromatin conformation, DNA methylation, and chromatin accessibility

Il genoma non è semplicemente una libreria statica di istruzioni conservata all'interno di una cellula; è una struttura tridimensionale dinamica che si ripiega e si torce per controllare come i geni vengono letti. Per capire come funziona la vita, gli scienziati devono osservare questa struttura da tre angolazioni diverse contemporaneamente. Primo, devono vedere come parti distanti del filamento di DNA si toccano e interagiscono, formando loop e ponti che mettono specifici geni sotto il controllo dei loro regolatori. Secondo, devono mappare i tag chimici attaccati al DNA, che agiscono come interruttori per accendere o spegnere i geni senza cambiare il codice sottostante. Terzo, devono identificare quali parti del DNA sono aperte e accessibili al macchinario cellulare, e quali parti sono strettamente impacchettate e nascoste. Per anni, i ricercatori hanno dovuto studiare queste tre caratteristiche separatamente, utilizzando esperimenti diversi su campioni diversi. Questo approccio lascia un vuoto: poiché le misurazioni vengono effettuate separatamente, è impossibile sapere esattamente come il ripiegamento, i tag chimici e l'accessibilità di un singolo pezzo di DNA si relazionino tra loro nello stesso istante.

Un team di ricercatori dell'Indiana University ha ora colmato questo divario con un nuovo metodo chiamato Epi-PoreC. Combinando tre tecniche consolidate in un unico flusso di lavoro, hanno creato un modo per catturare la forma, lo stato chimico e l'accessibilità del genoma, tutto sullo stesso singolo filamento di DNA. Il metodo si basa su una tecnologia nota come sequenziamento a nanopori, che legge il DNA estraendo lunghi filamenti attraverso un minuscolo poro proteico e misurando come cambia la corrente elettrica mentre la molecola passa. Questa tecnologia è abbastanza potente da leggere tratti molto lunghi di DNA, permettendo agli scienziati di vedere quanto siano distanti due punti che si toccano e di rilevare modifiche chimiche lungo il percorso. I ricercatori hanno testato il loro nuovo approccio sui nuclei di Arabidopsis thaliana, una piccola pianta a fiore ampiamente utilizzata nella ricerca biologica. Hanno preso tessuto vegetale, hanno isolato i nuclei cellulari e li hanno sottoposti a una serie di passaggi chimici progettati per congelare il DNA nella sua forma 3D naturale, marcare le regioni aperte e preparare i filamenti per la lettura.

Il processo inizia con il cross-linking del DNA per bloccare la sua struttura ripiegata in posizione. I ricercatori poi permeabilizzano i nuclei per consentire a un enzima di entrare e marcare le regioni accessibili del genoma con un tag chimico specifico. Questo passaggio, preso in prestito da una tecnica chiamata Fiber-seq, identifica quali parti del DNA sono aperte e disponibili per l'uso. Dopo questa marcatura, il DNA viene tagliato in pezzi gestibili e le estremità che si toccavano nello spazio 3D vengono incollate nuovamente, creando un registro fisico dell'architettura del genoma. Questo passaggio, noto come cattura della conformazione cromosomica, assicura che qualsiasi coppia di segmenti di DNA che fosse vicina nel nucleo rimanga connessa nel campione finale. I risultanti filamenti di DNA vengono quindi inseriti nel sequenziatore a nanopori. Mentre i lunghi filamenti passano attraverso i pori, la macchina legge la sequenza di lettere e simultaneamente rileva i tag chimici e le giunzioni dove i segmenti di DNA sono stati incollati insieme. Poiché l'intero processo avviene su una singola molecola, i ricercatori possono vedere esattamente quali tag chimici e quali connessioni strutturali appartengono allo stesso pezzo di DNA.

I risultati di questa integrazione sono stati sorprendenti. Quando il team ha confrontato le mappe generate dal loro nuovo metodo con le mappe create eseguendo le tre tecniche separatamente, i dati corrispondevano con una precisione straordinaria. I modelli di come i cromosomi si ripiegavano e si toccavano erano quasi identici a quelli osservati negli esperimenti standard, dimostrando che i passaggi aggiuntivi richiesti per marcare il DNA non avevano distorto la forma naturale del genoma. Allo stesso modo, le mappe chimiche dell'accessibilità del DNA e le posizioni delle modifiche chimiche naturali erano indistinguibili da quelle prodotte dai metodi indipendenti. I ricercatori hanno scoperto che il nuovo approccio poteva rilevare interazioni complesse, come quelle che avvengono nelle regioni dense e ripetitive vicino al centro dei cromosomi, che sono spesso difficili da studiare con altre tecnologie. Sebbene il nuovo metodo abbia prodotto letture di DNA leggermente più brevi rispetto alla versione standard della tecnica di mappatura strutturale, le lunghezze erano comunque sufficienti per rivelare gli intricati modelli di ripiegamento del genoma.

Questo lavoro dimostra che è possibile vedere il genoma come un sistema unificato piuttosto che come una collezione di parti separate. Catturando la forma, lo stato chimico e l'accessibilità del DNA tutto in una volta, Epi-PoreC fornisce un quadro più completo di come il genoma funziona. Il metodo è particolarmente prezioso per studiare le regioni complesse o ripetitive del genoma, dove le letture lunghe sono essenziali per distinguere una sezione dall'altra. I ricercatori hanno notato che, sebbene l'approccio sia altamente efficace, i passaggi enzimatici aggiuntivi introducono una leggera riduzione nella lunghezza dei filamenti di DNA che possono essere letti, il che potrebbe limitare la risoluzione nelle aree più impegnative. Tuttavia, la capacità di collegare direttamente l'architettura fisica del genoma al suo paesaggio chimico su una singola molecola apre nuove porte alla comprensione di come i geni siano regolati. Questa visione integrata permette agli scienziati di porre domande che prima erano impossibili da rispondere, come ad esempio come il ripiegamento di un particolare loop di DNA influenzi i tag chimici su quello stesso loop, o come l'accessibilità di una regione cambi quando interagisce con una parte distante del cromosoma. Man mano che la tecnologia continua a migliorare, questo tipo di analisi su singola molecola promette di approfondire la nostra comprensione della complessa macchina che guida la vita.