Epi-PoreC: a nanopore-based method for simultaneous profiling of chromatin conformation, DNA methylation, and chromatin accessibility

Das Genom ist nicht bloß eine statische Bibliothek von Anweisungen, die in einer Zelle gespeichert sind; es ist eine dynamische, dreidimensionale Struktur, die sich faltet und verdreht, um zu steuern, wie Gene abgelesen werden. Um zu verstehen, wie das Leben funktioniert, müssen Wissenschaftler diese Struktur aus drei verschiedenen Blickwinkeln gleichzeitig betrachten. Erstens müssen sie sehen, wie weit entfernte Teile des DNA-Strangs einander berühren und interagieren, indem sie Schleifen und Brücken bilden, die bestimmte Gene unter die Kontrolle ihrer Regulatoren bringen. Zweitens müssen sie die chemischen Markierungen kartieren, die an der DNA haften und wie Schalter wirken, die Gene an- oder ausschalten, ohne den zugrunde liegenden Code zu verändern. Drittens müssen sie identifizieren, welche Teile der DNA offen und für die zelluläre Maschinerie zugänglich sind und welche Teile dicht gepackt und verborgen liegen. Jahrelang mussten Forscher diese drei Merkmale separat untersuchen, indem sie verschiedene Experimente an unterschiedlichen Proben durchführten. Dieser Ansatz hinterlässt eine Lücke: Da die Messungen getrennt voneinander durchgeführt werden, ist es unmöglich zu wissen, wie die Faltung, die chemischen Markierungen und die Zugänglichkeit eines einzelnen DNA-Stücks im selben Moment miteinander in Beziehung stehen.

Ein Forschungsteam der Indiana University hat diese Lücke nun mit einer neuen Methode namens Epi-PoreC geschlossen. Durch die Kombination von drei etablierten Techniken in einem einzigen Arbeitsablauf haben sie einen Weg geschaffen, die Form, den chemischen Zustand und die Zugänglichkeit des Genoms alle an demselben einzelnen DNA-Molekül zu erfassen. Die Methode basiert auf einer Technologie, die als Nanoporen-Sequenzierung bekannt ist und die DNA liest, indem sie lange Stränge durch eine winzige Proteinpore zieht und misst, wie sich der elektrische Strom verändert, während das Molekül hindurchgleitet. Diese Technologie ist leistungsstark genug, um sehr lange DNA-Abschnitte zu lesen, was es Wissenschaftlern ermöglicht zu sehen, wie weit zwei berührende Punkte voneinander entfernt sind, und chemische Modifikationen entlang des Weges zu detektieren. Die Forscher testeten ihren neuen Ansatz an den Zellkernen von Arabidopsis thaliana, einer kleinen Blütenpflanze, die in der biologischen Forschung weit verbreitet ist. Sie nahmen Pflanzengewebe, isolierten die Zellkerne und unterzogen sie einer Reihe chemischer Schritte, die darauf ausgelegt waren, die DNA in ihrer natürlichen 3D-Form einzufrieren, die offenen Regionen zu markieren und die Stränge für das Ablesen vorzubereiten.

Der Prozess beginnt mit der Vernetzung (Crosslinking) der DNA, um ihre gefaltete Struktur an Ort und Stelle zu fixieren. Die Forscher permeabilisieren dann die Zellkerne, damit ein Enzym eintreten und die zugänglichen Regionen des Genoms mit einem spezifischen chemischen Tag markieren kann. Dieser Schritt, der von einer Technik namens Fiber-seq entlehnt wurde, identifiziert, welche Teile der DNA offen und für die Nutzung verfügbar sind. Nach dieser Markierung wird die DNA in handhabbare Stücke geschnitten, und die Enden, die im 3D-Raum einander berührt haben, werden wieder zusammengeklebt, wodurch ein physisches Abbild der Architektur des Genoms entsteht. Dieser Schritt, bekannt als Chromosomen-Konformations-Capture, stellt sicher, dass zwei DNA-Segmente, die im Zellkern eng beieinander lagen, auch im fertigen Sample miteinander verbunden bleiben. Die resultierenden DNA-Stränge werden dann in den Nanoporen-Sequenzierer eingespeist. Während die langen Stränge durch die Poren gleiten, liest die Maschine die Sequenz der Buchstaben und detektiert gleichzeitig die chemischen Markierungen sowie die Übergangsstellen, an denen die DNA-Segmente zusammengeklebt wurden. Da der gesamte Prozess an einem einzelnen Molekül stattfindet, können die Forscher genau sehen, welche chemischen Markierungen und welche strukturellen Verbindungen zu demselben DNA-Stück gehören.

Die Ergebnisse dieser Integration waren beeindruckend. Als das Team die durch ihre neue Methode erstellten Karten mit Karten verglich, die durch die Durchführung der drei Techniken separat erstellt worden waren, stimmten die Daten mit bemerkenswerter Präzision überein. Die Muster der Art und Weise, wie sich die Chromosomen falteten und einander berührten, waren nahezu identisch mit denen aus Standardexperimenten, was zeigte, dass die zusätzlichen Schritte zur Markierung der DNA die natürliche Form des Genoms nicht verzerrten. Ebenso waren die chemischen Karten der DNA-Zugänglichkeit und die Standorte natürlicher chemischer Modifikationen ununterscheidbar von denen, die durch die Einzelmethoden produziert wurden. Die Forscher fanden heraus, dass der neue Ansatz komplexe Interaktionen detektieren konnte, wie sie beispielsweise in den dichten, repetitiven Regionen nahe dem Zentrum der Chromosomen auftreten, die mit anderen Technologien oft schwer zu untersuchen sind. Obwohl die neue Methode etwas kürzere DNA-Reads als die Standardversion der strukturellen Kartierungstechnik produzierte, waren die Längen dennoch ausreichend, um die komplizierten Faltungsmuster des Genoms offenzulegen.

Diese Arbeit zeigt, dass es möglich ist, das Genom als ein einheitliches System und nicht als eine Sammlung separater Teile zu betrachten. Indem sie die Form, den chemischen Zustand und die Zugänglichkeit der DNA gleichzeitig erfassen, liefert Epi-PoreC ein vollständigeres Bild davon, wie das Genom funktioniert. Die Methode ist besonders wertvoll für die Untersuchung komplexer oder repetitiver Genomregionen, in denen lange Reads entscheidend sind, um eine Sektion von einer anderen zu unterscheiden. Die Forscher merkten an, dass der Ansatz zwar hocheffektiv ist, die zusätzlichen enzymatischen Schritte jedoch eine leichte Reduktion der Länge der gelesenen DNA-Stränge mit sich bringen, was die Auflösung in den anspruchsvollsten Bereichen einschränken könnte. Dennoch eröffnet die Fähigkeit, die physische Architektur des Genoms direkt mit seiner chemischen Landschaft auf einem einzelnen Molekül zu verknüpfen, neue Türen für das Verständnis der Genregulation. Diese integrierte Sichtweise ermöglicht es Wissenschaftlern, Fragen zu stellen, die zuvor unbeantwortbar waren, wie etwa, wie die Faltung einer spezifischen DNA-Schleife die chemischen Markierungen auf derselben Schleife beeinflusst oder wie sich die Zugänglichkeit einer Region ändert, wenn sie mit einem fernen Teil des Chromosoms interagiert. Während sich diese Technologie weiterentwickelt, verspricht diese Art der Einzelmolekül-Analyse, unser Verständnis der komplexen Mechanismen, die das Leben antreiben, zu vertiefen.