Epi-PoreC: a nanopore-based method for simultaneous profiling of chromatin conformation, DNA methylation, and chromatin accessibility

Het genoom is niet louter een statische bibliotheek van instructies die in een cel wordt opgeslagen; het is een dynamische, driedimensionale structuur die vouwt en draait om te controleren hoe genen worden afgelezen. Om te begrijpen hoe het leven werkt, moeten wetenschappers naar deze structuur vanuit drie verschillende hoeken tegelijkertijd kijken. Ten eerste moeten ze zien hoe verre delen van de DNA-streng elkaar raken en interageren, waardoor lussen en bruggen ontstaan die specifieke genen onder de controle van hun regulatoren brengen. Ten tweede moeten ze de chemische labels in kaart brengen die aan het DNA zijn bevestigd, die fungeren als schakelaars die genen aan- of uitzetten zonder de onderliggende code te veranderen. Ten derde moeten ze identificeren welke delen van het DNA open en toegankelijk zijn voor de cellulaire machinerie, en welke delen dicht opeengepakt en verborgen zijn. Jarenlang moesten onderzoekers deze drie kenmerken afzonderlijk bestuderen, met behulp van verschillende experimenten op verschillende monsters. Deze aanpak laat een gat achter: omdat de metingen apart worden genomen, is het onmogelijk om precies te weten hoe de vouwing, de chemische labels en de toegankelijkheid van een enkel stuk DNA op hetzelfde moment met elkaar samenhangen.

Een team van onderzoekers aan de Indiana University heeft dit gat nu overbrugd met een nieuwe methode genaamd Epi-PoreC. Door drie gevestigde technieken te combineren in één enkele workflow, hebben zij een manier gecreëerd om de vorm, de chemische staat en de toegankelijkheid van het genoom allemaal op hetzelfde individuele DNA-molecuul vast te leggen. De methode steunt op een technologie die bekend staat als nanopore-sequencing, waarbij DNA wordt afgelezen door lange strengen door een piepklein eiwitporie te trekken en te meten hoe de elektrische stroom verandert terwijl het molecuul erdoorheen passeert. Deze technologie is krachtig genoeg om zeer lange stukken DNA af te lezen, waardoor wetenschappers kunnen zien hoe ver twee contactpunten uit elkaar liggen en om chemische modificaties onderweg te detecteren. De onderzoekers testten hun nieuwe aanpak op de kernen van Arabidopsis thaliana, een kleine bloeiende plant die veel wordt gebruikt in biologisch onderzoek. Ze namen plantenweefsel, isoleerden de celkernen en onderwierpen deze vervolgens aan een reeks chemische stappen die ontworpen zijn om het DNA in zijn natuurlijke 3D-vorm te bevriezen, de open regio's te labelen en de strengen voor te bereiden voor het aflezen.

Het proces begint met het crosslinken van het DNA om de gevouwen structuur op zijn plaats te vergrendelen. Vervolgens maken de onderzoekers de kernen doorlaatbaar zodat een enzym kan binnendringen en de toegankelijke regio's van het genoom met een specifiek chemisch label kan markeren. Deze stap, geleend van een techniek genaamd Fiber-seq, identificeert welke delen van het DNA open en beschikbaar zijn voor gebruik. Na deze labeling wordt het DNA in hanteerbare stukken gesneden en worden de uiteinden die in de 3D-ruimte elkaar raakten weer aan elkaar gelijmd, waardoor een fysiek verslag van de architectuur van het genoom ontstaat. Deze stap, bekend als chromosoomconformatie-captuur, zorgt ervoor dat elk twee DNA-segmenten die dicht bij elkaar lagen in de kern, ook verbonden blijven in het uiteindelijke monster. De resulterende DNA-strengen worden vervolgens in de nanopore-sequencer gevoerd. Terwijl de lange strengen door de poriën passeren, leest de machine de sequentie van letters en detecteert tegelijkertijd de chemische labels en de verbindingen waar DNA-segmenten aan elkaar zijn gelijmd. Omdat het gehele proces op een enkel molecuul plaatsvindt, kunnen de onderzoekers precies zien welke chemische labels en welke structurele verbindingen bij hetzelfde stuk DNA horen.

De resultaten van deze integratie waren opmerkelijk. Wanneer het team de door hun nieuwe methode gegenereerde kaarten vergeleek met kaarten die waren gemaakt door de drie technieken afzonderlijk uit te voeren, kwamen de gegevens met opmerkelijke precisie overeen. De patronen van hoe de chromosomen vouwden en elkaar raakten, waren bijna identiek aan de patronen die werden gezien in standaardexperimenten, wat aantoont dat de extra stappen die nodig waren om het DNA te labelen de natuurlijke vorm van het genoom niet hebben vervormd. Evenzo waren de chemische kaarten van de DNA-toegankelijkheid en de locaties van natuurlijke chemische modificaties ononderscheidbaar van de resultaten die door de zelfstandige methoden werden geproduceerd. De onderzoekers ontdekten dat de nieuwe aanpak complexe interacties kon detecteren, zoals die voorkomen in de dichte, repetitieve regio's nabij het centrum van chromosomen, die vaak moeilijk te bestuderen zijn met andere technologieën. Hoewel de nieuwe methode iets kortere DNA-reads produceerde dan de standaardversie van de structurele mappingtechniek, waren de lengtes nog steeds voldoende om de ingewikkelde vouwpatronen van het genoom te onthullen.

Dit werk demonstreert dat het mogelijk is om het genoom te beschouwen als een verenigd systeem in plaats van een verzameling afzonderlijke onderdelen. Door de vorm, de chemische staat en de toegankelijkheid van het DNA allemaal tegelijkertijd vast te leggen, biedt Epi-PoreC een completer beeld van hoe het genoom functioneert. De methode is bijzonder waardevol voor het bestuderen van complexe of repetitieve regio's van het genoom, waar lange reads essentieel zijn om de ene sectie van de andere te onderscheiden. De onderzoekers merkten op dat hoewel de aanpak zeer effectief is, de aanvullende enzymatische stappen een lichte reductie introduceren in de lengte van de DNA-strengen die gelezen kunnen worden, wat de resolutie in de meest uitdagende gebieden zou kunnen beperken. Desalniet meer biedt het vermogen om de fysieke architectuur van het genoom direct te koppelen aan het chemische landschap op een enkel molecuul nieuwe mogelijkheden voor het begrijpen van hoe genen worden gereguleerd. Deze geïntegreerde kijk stelt wetenschappers in staat om vragen te stellen die voorheen onbeantwoordbaar waren, zoals hoe de vouwing van een specifieke DNA-lus de chemische labels op diezelfde lus beïnvloedt, of hoe de toegankelijkheid van een regio verandert wanneer deze interageert met een distant deel van het chromosoom. Naarmate de technologie blijft verbeteren, belooft deze vorm van single-molecule analyse ons begrip van de complexe machinerie die het leven aandrijft te verdiepen.