Epi-PoreC: a nanopore-based method for simultaneous profiling of chromatin conformation, DNA methylation, and chromatin accessibility
यह शोधपत्र Epi-PoreC को प्रस्तुत करता है, जो एक नवीन ऑक्सफोर्ड नैनोपोर-आधारित विधि है जो एकल ही एक परख (assay) के भीतर व्यक्तिगत डीएनए अणुओं पर क्रोमैटिन संरचना (chromatin conformation), डीएनए मिथाइलेशन और क्रोमैटिन सुलभता (chromatin accessibility) का एक साथ प्रोफाइल करती है।
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जीनोम केवल कोशिका के भीतर संग्रहीत निर्देशों का एक स्थिर पुस्तकालय मात्र नहीं है; यह एक गतिशील, त्रि-आयामी संरचना है जो यह नियंत्रित करने के लिए मुड़ती और घूमती है कि जीन को कैसे पढ़ा जाए। जीवन कैसे कार्य करता है इसे समझने के लिए, वैज्ञानिकों को इस संरचना को एक साथ तीन अलग-अलग कोणों से देखना चाहिए। पहला, उन्हें यह देखने की आवश्यकता है कि डीएनए स्ट्रैंड के दूर स्थित हिस्से कैसे एक-दूसरे को छूते हैं और परस्पर क्रिया करते हैं, जिससे लूप और पुल बनते हैं जो विशिष्ट जीनों को उनके नियामकों (regulators) के नियंत्रण में लाते हैं। दूसरा, उन्हें डीएनए से जुड़े रासायनिक टैग्स का मानचित्रण करना होगा, जो स्विच की तरह कार्य करते हैं जो अंतर्निहित कोड को बदले बिना जीनों को चालू या बंद कर देते हैं। तीसरा, उन्हें यह पहचानना होगा कि डीएनए के कौन से हिस्से खुले और सुलभ हैं, और कौन से हिस्से कसकर पैक और छिपे हुए हैं। वर्षों तक, शोधकर्ताओं को इन तीन विशेषताओं का अलग-अलग अध्ययन करना पड़ता था, जिसमें विभिन्न नमूनों पर अलग-अलग प्रयोगों का उपयोग किया जाता था। यह दृष्टिकोण एक अंतराल छोड़ देता है: क्योंकि माप अलग-अलग लिए जाते हैं, यह जानना असंभव है कि एक ही डीएनए के टुकड़े के लिए फोल्डिंग, रासायनिक टैग और सुलभता एक ही क्षण में एक-दूसरे से सटीक रूप से कैसे संबंधित हैं।
इंडियाना यूनिवर्सिटी के शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब 'एपी-पोरसी' (Epi-PoreC) नामक एक नई विधि के माध्यम से इस अंतर को पाट दिया है। तीन स्थापित तकनीकों को एक एकल वर्कफ़्लो में जोड़कर, उन्होंने एक ऐसा तरीका बनाया है जिससे वे एक ही व्यक्तिगत डीएनए अणु पर जीनोम के आकार, रासायनिक अवस्था और सुलभता को कैप्चर कर सकें। यह विधि नैनोपोर सीक्वेंसिंग नामक तकनीक पर आधारित है, जो डीएनए को एक सूक्ष्म प्रोटीन छिद्र (pore) के माध्यम से खींचकर और अणु के गुजरने पर विद्युत धारा में होने वाले परिवर्तन को मापकर डीएनए को पढ़ती है। यह तकनीक बहुत लंबे डीएनए खंडों को पढ़ने में सक्षम है, जिससे वैज्ञानिक देख सकते हैं कि दो छूते हुए बिंदु एक-दूसरे से कितनी दूर हैं और इस प्रक्रिया के दौरान रासायनिक संशोधनों का पता लगा सकते हैं। शोधकर्ताओं ने अपने नए दृष्टिकोण का परीक्षण अरैबिडोप्सिस थैलियाना (Arabidopsis thaliana) के नाभिक (nuclei) पर किया, जो जैविक अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला एक छोटा फूल वाला पौधा है। उन्होंने पौधे के ऊतकों को लिया, कोशिका नाभिक को अलग किया, और फिर डीएनए को उसकी प्राकृतिक 3D आकृति में जमाने, खुले क्षेत्रों को लेबल करने और स्ट्रैंड्स को पढ़ने के लिए तैयार करने के लिए डिज़ाइन किए गए रासायनिक चरणों की एक श्रृंखला के अधीन किया।
प्रक्रिया डीएनए को क्रॉसलिंक करके शुरू होती है ताकि इसकी मुड़ी हुई संरचना को अपनी जगह पर लॉक किया जा सके। इसके बाद शोधकर्ता नाभिक को पारगम्य (permeabilize) बनाते हैं ताकि एक एंजाइम प्रवेश कर सके और जीनोम के सुलभ क्षेत्रों को एक विशिष्ट रासायनिक टैग के साथ चिह्नित कर सके। यह चरण, जिसे 'फाइबर-सीक' (Fiber-seq) नामक तकनीक से लिया गया है, यह पहचानता है कि डीएनए के कौन से हिस्से खुले और उपयोग के लिए उपलब्ध हैं। इस लेबलिंग के बाद, डीएनए को प्रबंधनीय टुकड़ों में काटा जाता है और जो सिरे 3D स्थान में एक-दूसरे को छू रहे थे, उन्हें वापस चिपका दिया जाता है, जिससे जीनोम की वास्तुकला का एक भौतिक रिकॉर्ड बनता है। यह चरण, जिसे क्रोमोसोम कॉन्फ़ॉर्मेशन कैप्चर कहा जाता है, यह सुनिश्चित करता है कि नाभिक में जो भी दो डीएनए खंड पास थे, वे अंतिम नमूने में जुड़े रहें। परिणामी डीएनए स्ट्रैंड्स को फिर नैनोपोर अनुक्रमक (sequencer) में डाला जाता है। जैसे ही लंबी स्ट्रैंड्स छिद्रों से गुजरती हैं, मशीन अक्षरों के अनुक्रम को पढ़ती है और साथ ही रासायनिक टैग और उन जंक्शनों का पता लगाती है जहाँ डीएनए खंडों को जोड़ा गया था। चूंकि पूरी प्रक्रिया एक ही अणु पर होती है, इसलिए शोधकर्ता देख सकते हैं कि कौन से रासायनिक टैग और कौन से संरचनात्मक संबंध उसी डीएनए के टुकड़े के हैं।
इस एकीकरण के परिणाम आश्चर्यजनक थे। जब टीम ने अपने नए तरीके द्वारा उत्पन्न मानचित्रों की तुलना उन मानचित्रों से की जो तीन तकनीकों को अलग-अलग चलाने से बनाए गए थे, तो डेटा उल्लेखनीय सटीकता के साथ मेल खाया। गुणसूत्रों के मुड़ने और एक-दूसरे को छूने के पैटर्न लगभग वही थे जो मानक प्रयोगों में देखे गए थे, जिससे पता चलता कि डीएनए को लेबल करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त चरणों ने जीनोम के प्राकृतिक आकार को विकृत नहीं किया। इसी प्रकार, डीएनए की सुलभता के रासायनिक मानचित्र और प्राकृतिक रासायनिक संशोधनों के स्थान, स्टैंडअलोन विधियों द्वारा उत्पादित मानचित्रों से अभिन्न थे। शोधकर्ताओं ने पाया कि नया दृष्टिकोण जटिल अंतःक्रियाओं का पता लगा सकता है, जैसे कि गुणसूत्रों के केंद्र के पास घने, दोहराव वाले क्षेत्रों में होने वाली अंतःक्रियाएं, जो अक्सर अन्य तकनीकों के साथ अध्ययन करने में कठिन होती हैं। हालांकि नई विधि ने मानक संरचनात्मक मैपिंग तकनीक की तुलना में थोड़े छोटे डीएनए रीड्स (reads) उत्पन्न किए, फिर भी उनकी लंबाई जीनोम के जटिल फोल्डिंग पैटर्न को प्रकट करने के लिए पर्याप्त थी।
यह कार्य यह प्रदर्शित करता है कि जीनोम को अलग-अलग हिस्सों के संग्रह के बजाय एक एकीकृत प्रणाली के रूप में देखना संभव है। डीएनए के आकार, रासायनिक अवस्था और सुलभता को एक साथ कैप्चर करके, एपी-पोरसी (Epi-PoreC) यह बताता है कि जीनोम कैसे कार्य करता है। यह विधि विशेष रूप से जीनोम के जटिल या दोहराव वाले क्षेत्रों के अध्ययन के लिए मूल्यवान है, जहाँ एक खंड को दूसरे से अलग करने के लिए लंबे रीड्स आवश्यक हैं। शोधकर्ताओं ने उल्लेख किया कि हालांकि यह दृष्टिकोण अत्यधिक प्रभावी है, लेकिन अतिरिक्त एंजाइमेटिक चरण डीएनए स्ट्रैंड्स की लंबाई में थोड़ी कमी लाते हैं, जो सबसे चुनौतीपूर्ण क्षेत्रों में रिज़ॉल्यूशन को सीमित कर सकता है। फिर भी, जीनोम की भौतिक वास्तुकला को सीधे उसके रासायनिक परिदृश्य से एक ही अणु पर जोड़ने की क्षमता, जीन कैसे विनियमित होते हैं, इसे समझने के नए द्वार खोलती है। यह एकीकृत दृश्य वैज्ञानिकों को ऐसे प्रश्न पूछने की अनुमति देता है जो पहले अनुत्तरित थे, जैसे कि एक विशिष्ट डीएनए लूप की फोल्डिंग उसी लूप पर रासायनिक टैग को कैसे प्रभावित करती है, या जब कोई क्षेत्र गुणसूत्र के दूरस्थ भाग के साथ परस्पर क्रिया करता है तो उसकी सुलभता कैसे बदल जाती है। जैसे-जैसे यह तकनीक बेहतर होती जा रही है, इस तरह का सिंगल-मॉलिक्यूल विश्लेषण जीवन को संचालित करने वाली जटिल मशीनरी की हमारी समझ को गहरा करने का वादा करता है।
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