Fluorescent Ubiquitination-based Trbl Turnover Indicator (FUTTI): A tool to detect activity of the Tribbles pseudokinase in vivo

All'interno di ogni cellula vivente, si svolge una battaglia costante e silenziosa per mantenere l'ordine. Le cellule devono decidere quali proteine tenere e quali scartare, un processo essenziale per la crescita, lo sviluppo e la prevenzione delle malattie. Questa decisione si basa spesso su un sistema di etichette molecolari che segnano specifiche proteine per la distruzione, inviandole al centro di riciclaggio della cellula. Tra le molte molecole che aiutano a dirigere questa squadra di pulizia ci sono una famiglia di proteine chiamate Tribbles. Queste molecole agiscono come adattatori, colmando il divario tra una proteina bersaglio che deve essere rimossa e il macchinario che effettivamente la distrugge. Sebbene queste proteine siano vitali per un normale sviluppo, il loro malfunzionamento è collegato a gravi condizioni, tra cui alcuni tipi di cancro, in cui possono distruggere proteine sane troppo velocemente o non riuscire a rimuovere quelle dannose. Comprendere esattamente come lavorano questi adattatori, e quali parti della loro struttura siano essenziali per il loro compito, è stata una sfida perché gli scienziati mancavano di un modo semplice per osservarli in azione all'interno di un organismo vivente.

I ricercatori dell'Università del Missouri-Kansas City hanno sviluppato un nuovo strumento per risolvere questo problema, permettendo loro di vedere dove e quando questi adattatori proteici sono attivi all'interno di una mosca della frutta vivente. Hanno creato un sensore che brilla di una luce fluorescente, che si affievolisce ogni volta che l'adattatore proteico funziona correttamente. Osservando questa luce, hanno potuto mappare l'attività dell'adattatore proteico in tempo reale e testare quali parti della proteina siano necessarie affinché essa funzioni. Il loro lavoro ha rivelato che, sebbene queste proteine condividano una struttura comune in molti animali, il meccanismo specifico che utilizzano per reclutare il macchinario di distruzione nelle mosche della frutta è unico e differisce significamente dal metodo utilizzato nei mammiferi.

Gli scienziati hanno iniziato progettando un sensore basato su una specifica proteina bersaglio nota per essere controllata dall'adattatore. Nelle mosche della frutta, questo bersaglio è una proteina chiamata Slbo, che svolge un ruolo chiave nello sviluppo dell'ovaio. I ricercatori hanno identificato una piccola sezione specifica della proteina Slbo che funge da segnale per la distruzione, una regione che l'adattatore proteico riconosce e a cui si lega. Hanno preso questo segnale e lo hanno attaccato a una proteina fluorescente, creando una molecola ibrida che brilla di verde o rosso. In condizioni normali, questa molecola luminosa si accumulerebbe e brillerebbe intensamente. Tuttavia, se l'adattatore proteico fosse presente e attivo, riconoscerebbe il segnale, etichetterebbe la molecola luminosa e la invierebbe per essere distrutta, facendo svanire la luce. I ricercatori hanno chiamato questo sensore FUTTI, un indicatore fluorescente dell'attività di turnover dell'adattatore.

Per testare se questo sensore funzionasse, i ricercatori lo hanno introdotto in mosche della frutta e hanno osservato i modelli di luminescenza nei loro tessuti. Nello sviluppo delle ali delle mosche, hanno scoperto che quando l'adattatore proteico è presente in grandi quantità, il sensore luminoso scompare da quelle specifiche cellule, confermando che il sensore viene distrutto come previsto. Al contrario, riducendo la quantità dell'adattatore proteico, il sensore si accumulava e brillava molto di più. Questa relazione inversa ha dimostrato che il sensore poteva riportare accuratamente i livelli di attività dell'adattatore proteico in diverse parti del corpo della mosca. Hanno osservato risultati simili nelle ovaie, dove il sensore si affievoliva in cellule specifiche dove l'adattatore era noto per essere attivo, dimostrando che lo strumento poteva mappare l'attività in diversi tessuti con alta precisionità.

Con un sensore funzionante in mano, il team è passato a investigare le parti specifiche dell'adattatore proteico che lo fanno funzionare. Sapevano che l'adattatore proteico possiede una regione centrale che si lega al segnale bersaglio e una regione terminale (tail) che recluta il macchinario di distruzione. Per testare l'importanza della regione centrale di legame, hanno creato una versione dell'adattatore con un piccolo, minuscolo cambiamento nella sua struttura, sostituendo un amminoacido con un altro. Esprimendo questa proteina alterata nelle mosche, il sensore rimaneva luminoso e non scompariva. Questo risultato ha mostrato che la regione centrale di legame è essenziale affinché l'adattatore riconosca il suo bersaglio; senza di essa, l'adattatore non può afferrare il sensore per distruggerlo. Interessantemente, questa versione guasta dell'adattatore influenzava ancora altri processi cellulari, come la divisione cellulare, suggerendo che diverse parti della proteina controllino funzioni differenti.

I ricercatori si sono poi concentrati sulla coda della proteina, responsabile del reclutamento del macchinario di distruzione. Nei mammiferi, questa coda contiene una sequenza specifica che si lega a un enzima ben noto chiamato COP1, che aiuta a etichettare le proteine per la distruzione. Il team ha testato se questo stesso meccanismo funzionasse nelle mosche della frutta. Per prima cosa, hanno cercato di vedere se le versioni mammifere dell'adattatore proteico potessero funzionare nella mosca. Hanno espresso versioni di topo dell'adattatore nelle mosche, ma il sensore rimaneva luminoso, indicando che le proteine dei mammiferi non potevano distruggere il sensore della mosca. Anche aggiungendo l'enzima COP1 del topo al mix, gli adattatori dei mammiferi non sono riusciti comunque a funzionare, suggerendo che le proteine del topo e il sensore della mosca siano incompatibili.

Questo ha portato il team a investigare la struttura unica della coda dell'adattatore della mosca della frutta. Hanno scoperto che la versione della mosca manca del sito di legame specifico per l'enzima COP1 presente nei mammiferi. Inveve, la proteina della mosca ha una coda più lunga con una diversa sequenza di amminoacidi. Eliminando sistematicamente parti di questa coda, hanno scoperto che una regione specifica, contenente una breve sequenza di quattro amminoacidi, era critica per la funzione della proteina. Quando hanno mutato questa specifica sequenza, l'adattatore ha perso la capacità di distruggere il sensore e la luce è rimasta brillante. Questa scoperta suggerisce che l'adattatore della mosca della frutta utilizzi un meccanismo unico per reclutare il macchinario di distruzione, uno che non dipende dall'enzima COP1 utilizzato dai mammiferi.

Lo studio evidenzia una affascinante divergenza evolutiva. Mentre la funzione centrale di queste proteine adattatrici — riconoscere un bersaglio e segnarlo per la distruzione — è conservata in molti animali, gli strumenti specifici che utilizzano per svolgere il compito sono cambiati. Nei mammiferi, l'adattatore si affida a un'interazione specifica con l'enzima COP1. Nelle mosche della frutta, l'adattatore ha evoluto una strategia diversa, utilizzando un motivo unico nella sua coda per ottenere lo stesso risultato. Questa scoperta non solo fornisce un nuovo strumento agli scienziati per studiare queste proteine in organismi viventi, ma approfondisce anche la nostra comprensione di come il macchinario molecolare possa evolvere soluzioni diverse allo stesso problema biologico. Il sensore FUTTI offre un modo chiaro e visivo per tracciare queste attività, aprendo la strada a ulteriori ricerche su come queste proteine influenzino lo sviluppo e le malattie in una vasta gamma di specie.