Fluorescent Ubiquitination-based Trbl Turnover Indicator (FUTTI): A tool to detect activity of the Tribbles pseudokinase in vivo

모든 살아있는 세포 내부에서는 질서를 유지하기 위해 끊임없이 조용한 전투가 벌어집니다. 세포는 어떤 단백질을 유지하고 어떤 것을 버릴지 결정해야 하며, 이 과정은 성장, 발달 및 질병 예방에 필수적입니다. 이러한 결정은 종종 특정 단백질을 파괴 대상으로 표시하여 세포의 재활용 센터로 보내는 분자 태그 시스템에 의존합니다. 이 청소 부대를 안내하는 데 도움을 주는 많은 분자 중에는 트리블(Tribles)이라 불리는 단백질 가족이 있습니다. 이 분자들은 어댑터 역할을 하여, 제거되어야 할 표적 단백질과 실제로 그것을 파괴하는 기계 사이의 간극을 메워줍니다. 이 단백질들은 정상적인 발달에 매우 중요하지만, 이들의 기능 이상은 건강한 단백질을 너무 빨리 파괴하거나 해로운 것을 제거하지 못하는 등의 특정 유형의 암을 포함한 심각한 질환과 연관되어 있습니다. 과학자들이 살아있는 유기체 내에서 이들이 작동하는 모습을 관찰할 수 있는 간단한 방법을 갖추지 못했기 때문에, 이 어댑터들이 정확히 어떻게 작동하는지, 그리고 그 구조의 어떤 부분이 직무 수행에 필수적인지를 이해하는 것은 도전 과제였습니다.

미주리-캔자스시티 대학교의 연구진은 이 문제를 해결할 수 있는 새로운 도구를 개발하여, 살아있는 초파리 내부에서 이 어댑터 단백질이 언제 어디서 활성화되는지 볼 수 있게 했습니다. 그들은 어댑터 단백질이 정상적으로 작동할 때마다 빛이 흐려지는 형광 빛을 내는 센서를 만들었습니다. 이 빛을 관찰함으로써, 그들은 실시간으로 어댑터 단백질의 활동을 지도화하고 어떤 부분이 단백질의 기능을 수행하는 데 필요한지 테스트할 수 있었습니다. 그들의 연구는 이 단백-질들이 많은 동물에서 공통된 구조를 공유하지만, 초파리에서 파괴 기계를 모집하는 데 사용하는 구체적인 메커니즘은 고유하며 포유류가 사용하는 방식과는 크게 다르다는 것을 밝혀냈습니다.

과학자들은 어댑터에 의해 제어되는 것으로 알려진 특정 표적 단백질을 기반으로 센서를 설계하는 것부터 시작했습니다. 초파리에서 이 표적은 난소 발달에 핵심적인 역할을 하는 Slbo라는 단백질입니다. 연구진은 Slbo 단백질에서 파괴 신호로 작고 특정한 섹션을 식별했는데, 이는 어댑터 단백질이 인식하고 결합하는 영역입니다. 그들은 이 신호를 형광 단백질에 부착하여 녹색 또는 적색으로 빛나는 하이브리드 분자를 만들었습니다. 정상적인 조건에서 이 빛나는 분자는 축적되어 밝게 빛날 것입니다. 그러나 어댑터 단백질이 존재하고 활성화되어 있다면, 그것은 신호를 인식하고 빛나는 분자를 태그하여 파괴 단계로 보낼 것이며, 이로 인해 빛이 사라지게 됩니다. 연구진은 이 센서를 어댑터의 회전(turnover) 활성을 나타내는 형광 지표인 FUTTI라고 명명했습니다.

센서가 제대로 작동하는지 테스트하기 위해 연구진은 이를 초파리에 도입하고 조직 내에서의 빛나는 패턴을 관찰했습니다. 초파리의 발달 중인 날개에서, 어댑터 단백질이 많이 존재할 때 빛나는 센서가 해당 세포에서 사라지는 것을 발견했으며, 이는 센서가 의도한 대로 파괴되고 있음을 확인해 주었습니다. 반대로, 어댑터 단백질의 양을 줄였을 때는 센서가 축적되어 훨씬 더 밝게 빛났습니다. 이러한 역관계는 센서가 초파이 몸의 서로 다른 부위에서 어댑터 단의 활성 수준을 정확하게 보고할 수 있음을 증명했습니다. 그들은 어댑터가 활발하게 작동하는 것으로 알려진 특정 세포에서 센서가 어두워지는 유사한 결과를 난소에서도 관찰하였으며, 이는 이 도구가 높은 정밀도로 다양한 조직에서 활동을 지도화할 수 있음을 입증했습니다.

작동하는 센서를 손에 넣은 팀은 어댑터 단백질을 작동하게 만드는 구체적인 부분들을 조사하는 단계로 넘어갔습니다. 그들은 어댑터 단백질이 표적 신호와 결합하는 중앙 영역과 파괴 기계를 모집하는 꼬리 영역을 가지고 있다는 것을 알고 있었습니다. 중앙 결합 영역의 중요성을 테스트하기 위해, 그들은 하나의 아미노산을 다른 것으로 교체하는 아주 작은 구조적 변화를 준 버전의 어 la 어댑터를 만들었습니다. 이 변형된 단백질을 초파리에 발현시켰을 때, 센서는 여전히 밝게 유지되었고 사라지지 않았습니다. 이 결과는 중앙 결합 영역이 어댑터가 표적을 인식하는 데 필수적임을 보여주었습니다. 즉, 이 영역 없이는 어댑터가 센서를 붙잡아 파괴할 수 없습니다. 흥미롭게도, 이 고장 난 버전의 어댑터는 여전히 세포 분열과 같은 다른 세포 과정에 영향을 미쳤는데, 이는 단백질의 서로 다른 부분이 서로 다른 기능을 제어함을 시사합니다.

연구진은 다음으로 파괴 기계를 모집하는 책임을 가진 단백질의 꼬리에 주목했습니다. 포유류에서 이 꼬리는 단백질을 파괴 대상으로 태그하는 데 도움을 주는 COP1이라는 잘 알려진 효소와 결합하는 특정 서열을 포함하고 있습니다. 팀은 이와 동일한 메커니즘이 초파리에서도 작동하는지 테스트했습니다. 먼저, 포유류 버전의 어댑터 단백질이 초파리에서 작동할 수 있는지 시도했습니다. 그들은 생쥐 버전의 어댑터를 초파리에 발현시켰지만, 센서는 여전히 밝게 유지되었으며, 이는 포유류 단백질이 초파리 센서를 파괴할 수 없음을 나타냈습니다. 생쥐의 COP1 효소를 함께 추가했음에도 불구하고, 포유류 어댑터는 여전히 작동하지 않았으며, 이는 생쥐의 단백질과 초파리의 센서가 서로 호환되지 않음을 시사했습니다.

이는 팀이 초파리 어댑터 꼬리의 독특한 구조를 조사하도록 이끌었습니다. 그들은 초파리 버전의 꼬리가 포유류에서 발견되는 COP1 효소에 대한 특정 결합 부위가 결여되어 있다는 것을 발견했습니다. 대신, 초파리 단백질은 다른 아미노산 서열을 가진 더 긴 꼬리를 가지고 있습니다. 이 꼬리의 일부를 체계적으로 삭제함으로써, 그들은 네 개의 아미노산으로 이루어진 짧은 서열을 포함하는 특정 영역이 단백질의 기능에 결정적이라는 것을 발견했습니다. 이 특정 서열을 돌연변이로 만들었을 때, 어댑터는 센서를 파괴하는 능력을 잃었고 빛은 밝게 유지되었습니다. 이 발견은 초파리 어댑터가 포в 유류가 사용하는 COP1 효소에 의존하지 않는, 고유한 메커니즘을 사용하여 파괴 기계를 모집한다는 것을 시사합니다.

이 연구는 매혹적인 진화적 분기를 강조합니다. 이러한 어댑터 단백질의 핵심 기능인 표적을 인식하고 파괴를 위해 표시하는 기능은 동물 전반에 걸쳐 보존되어 있지만, 그 일을 수행하기 위해 사용하는 구체적인 도구들은 변화해 왔습니다. 포유류에서 어댑터는 COP1 효소와의 특정 상호작용에 의존합니다. 반면 초파리에서 어댑터는 동일한 결과를 얻기 위해 꼬리에 있는 고유한 모티프를 활용하는 다른 전략을 진화시켰습니다. 이 발견은 과학자들이 살아있는 유기체 내에서 이러한 단백질을 연구할 수 있는 새로운 도구를 제공할 뿐만 아니라, 분자 기계가 어떻게 동일한 생물학적 문제에 대해 서로 다른 해결책을 진화시킬 수 있는지에 대한 이해를 심화시킵니다. FUTTI 센서는 이러한 활동을 추적할 수 있는 명확하고 시각적인 방법을 제공하며, 다양한 종에서 이러한 단백질이 발달과 질병에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 추가 연구의 문을 열어줍니다.