Fluorescent Ubiquitination-based Trbl Turnover Indicator (FUTTI): A tool to detect activity of the Tribbles pseudokinase in vivo

In jeder lebenden Zelle findet ein ständiger, leiser Kampf statt, um die Ordnung aufrechtzuerhalten. Zellen müssen entscheiden, welche Proteine sie behalten und welche sie entsorgen – ein Prozess, der für Wachstum, Entwicklung und die Vermeidung von Krankheiten essenziell ist. Diese Entscheidung beruht oft auf einem System molekularer Markierungen, die spezifische Proteine für die Zerstörung kennzeichnen und sie zum Recyclingzentrum der Zelle senden. Zu den vielen Molekülen, die diese Aufräumtruppe leiten, gehört eine Familie von Proteinen namens Tribbles. Diese Moleküle fungieren als Adapter, die die Lücke zwischen einem Zielprotein, das entfernt werden muss, und der Maschinerie, die es tatsächlich zerstört, überbrücken. Obwohl diese Proteine für die normale Entwicklung lebenswichtig sind, wird ihre Fehlfunktion mit ernsten Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter bestimmte Arten von Krebs, bei denen sie gesunde Proteine zu schnell zerstören oder schädliche Proteine nicht rechtzeitig entfernen können. Genau zu verstehen, wie diese Adapter funktionieren und welche Teile ihrer Struktur für ihre Aufgabe entscheidend sind, war eine Herausforderung, da es den Wissenschaftlern an einer einfachen Möglichkeit fehlte, ihnen in einem lebenden Organismus bei der Arbeit zuzusehen.

Forscher an der University of Missouri-Kansas City haben ein neues Werkzeug entwickelt, um dieses Problem zu lösen, mit dem sie sehen können, wo und wann diese Adapterproteine in einer lebenden Fruchtfliege aktiv sind. Sie entwickelten einen Sensor, der mit einem fluoreszierenden Licht leuchtet, das dunkler wird, sobald das Adapterprotein korrekt arbeitet. Durch das Beobachten dieses Lichts konnten sie die Aktivität des Adapterproteins in Echtzeit kartieren und testen, welche Teile des Proteins für seine Funktion notwendig sind. Ihre Arbeit ergab, dass diese Proteine zwar eine gemeinsame Struktur in vielen Tieren teilen, der spezifische Mechanismus, mit dem sie die Zerstörungsmaschinerie in Fruchtfliegen rekrutieren, jedoch einzigartig ist und sich erheblich von der Methode unterscheidet, die in Säugetieren angewendet wird.

Die Wissenschaftler begannen damit, einen Sensor basierend auf einem spezifischen Zielprotein zu entwerfen, das bekanntlich durch den Adapter kontrolliert wird. In Fruchtfliegen ist dieses Ziel ein Protein namens Slbo, das eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung des Eierstocks spielt. Die Forscher identifizierten einen kleinen, spezifischen Abschnitt des Slbo-Proteins, der als Signal für die Zerstörung dient – eine Region, die das Adapterprotein erkennt und an sich bindet. Sie nahmen dieses Signal und hefteten es an ein fluoreszierendes Protein an, wodurch ein Hybridmolekül entstand, das grün oder rot leuchtet. Unter normalen Bedingungen würde dieses leuchtende Molekül akkumulieren und hell strahlen. Wenn jedoch das Adapterprotein vorhanden und aktiv wäre, würde es das Signal erkennen, das leuchtende Molekül markieren und es zur Zerstörung senden, was dazu führt, dass das Licht verblasst. Die Forscher nannten diesen Sensor FUTTI, ein fluoreszierender Indikator der Turnover-Aktivität des Adapters.

Um zu testen, ob dieser Sensor funktionierte, führten die Forscher ihn in Fruchtfliegen ein und beobachteten die Leuchtmuster in deren Geweben. In den sich entwickelnden Flügeln der Fliegen fanden sie heraus, dass das leuchtende Sensor-Molekül aus jenen spezifischen Zellen verschwand, in denen das Adapterprotein in hohen Mengen vorhanden war, was bestätigte, dass der Sensor wie beabsichtigt zerstört wurde. Umgekehrt, wenn sie die Menge des Adapterproteins reduzierten, akkumulierte der Sensor und leuchtete viel heller. Diese inverse Beziehung bewies, dass der Sensor die Aktivitätslevel des Adapterproteins in verschiedenen Teilen des Körpers der Fliege genau melden konnte. Sie sahen ähnliche Ergebnisse in den Eierstöcken, wo der Sensor in spezifischen Zellen, in denen der Adapter bekanntlich aktiv war, schwächer wurde, was zeigte, dass das Werkzeug in der Lage ist, die Aktivität über verschiedene Gewebe hinweg mit hoher Präzision abzubilden.

Mit einem funktionierenden Sensor in der Hand untersuchte das Team im Anschluss die spezifischen Teile des Adapterproteins, die es funktionsfähig machen. Sie wussten, dass das Adapterprotein eine zentrale Region besitzt, die an das Zielsignal bindet, und eine Schwanzregion, die die Zerstörungsmaschinerie rekrutiert. Um die Bedeutung der zentralen Bindungsregion zu testen, erstellten sie eine Version des Adapters mit einer einzigen, winzigen Änderung in seiner Struktur, indem sie eine Aminosäure gegen eine andere austauschten. Als sie dieses veränderte Protein in den Fliegen exprimierten, blieb der Sensor hell und verschwand nicht. Dieses Ergebnis zeigte, dass die zentrale Bindungsregion essenziell dafür ist, dass der Adapter sein Ziel erkennt; ohne sie kann der Adapter den Sensor nicht greifen, um ihn zu zerstören. Interessanterweise beeinflusste diese defekte Version des Adapters immer noch andere zelluläre Prozesse, wie etwa die Zellteilung, was darauf hindeutet, dass verschiedene Teile des Proteins unterschiedliche Funktionen steuern.

Die Forscher wandten sich dann dem Schwanz des Proteins zu, der für die Rekrutierung der Zerstörungsmaschinerie verantwortlich ist. In Säugetieren enthält dieser Schwanz eine spezifische Sequenz, die an ein bekanntes Enzym namens COP1 bindet, welches hilft, Proteine für die Zerstörung zu markieren. Das Team testete, ob derselbe Mechanismus auch in Fruchtfliegen funktioniert. Zuerst versuchten sie zu sehen, ob die Säugetier-Versionen des Adapterproteins in der Fliege funktionieren könnten. Sie exprimierten Maus-Versionen des Adapters in den Fliegen, aber der Sensor blieb hell, was darauf hindeutete, dass die Säugetier-Proteine den Fliegen-Sensor nicht zerstören konnten. Selbst als sie das Maus-COP1-Enzym hinzufügten, konnten die Säugetier-Adapter den Sensor immer noch nicht zerstören, was darauf hindeutete, dass die Maus-Proteine und der Fliegen-Sensor inkompatibel sind.

Dies veranlasste das Team dazu, den einzigartigen Aufbau des Schwanzes des Fruchtfliegen-Adapters zu untersuchen. Sie entdeckten, dass die Fruchtfliegen-Version die spezifische Bindungsstelle für das COP1-Enzym, die in Säugetieren vorkommt, nicht besitzt. Stattdessen hat das Fliegen-Protein einen längeren Schwanz mit einer anderen Abfolge von Aminosäuren. Durch das systematische Deletieren von Teilen dieses Schwanzes fanden sie heraus, dass eine spezifische Region, die eine kurze Sequenz von vier Aminosäuren enthält, entscheidend für die Funktion des Proteins war. Als sie diese spezifische Sequenz mutierten, verlor der Adapter die Fähigkeit, den Sensor zu zerstören, und das Licht blieb hell. Dieser Befund legt nahe, dass der Fruchtfliegen-Adapter einen einzigartigen Mechanismus nutzt, um die Zerstörungsmaschinerie zu rekrutieren – einen Mechanismus, der nicht auf das in Säugetieren verwendete COP1-Enzym angewiesen ist.

Die Studie unterstreicht eine faszinierende Divergenz in der Evolution. Während die Kernfunktion dieser Adapterproteine – die Erkennung eines Ziels und die Markierung zu dessen Zerstörung – über viele Tierarten hinweg konserviert ist, haben sich die spezifischen Werkzeuge, die sie für diese Aufgabe nutzen, verändert. In Säugetieren verlässt sich der Adapter auf eine spezifische Interaktion mit dem COP1-Enzym. In Fruchtfliegen hat der Adapter eine andere Strategie entwickelt und nutzt ein einzigartiges Motiv in seinem Schwanz, um dasselbe Ergebnis zu erzielen. Diese Entdeckung bietet Wissenschaftlern nicht nur ein neues Werkzeug, um diese Proteine in lebenden Organismen zu untersuchen, sondern vertieft auch unser Verständnis darüber, wie molekulare Maschinen unterschiedliche Lösungen für dasselbe biologische Problem entwickeln können. Der FUTTI-Sensor bietet einen klaren, visuellen Weg, um diese Aktivitäten zu verfolgen, und öffnet die Tür für weitere Forschungen darüber, wie diese Proteine die Entwicklung und Krankheiten in einer Vielzahl von Spezies beeinflussen.