Fluorescent Ubiquitination-based Trbl Turnover Indicator (FUTTI): A tool to detect activity of the Tribbles pseudokinase in vivo

In elke levende cel vindt een constante, stille strijd plaats om de orde te handhaven. Cellen moeten beslissen welke eiwitten ze behouden en welke ze weggooien, een proces dat essentieel is voor groei, ontwikkeling en het voorkomen van ziekten. Deze beslissing berust vaak op een systeem van moleculaire labels die specifieke eiwitten markeren voor vernietiging, waardoor ze naar het recyclingcentrum van de cel worden gestuurd. Onder de vele moleculen die deze opruimploeg helpen aansturen, behort een familie van eiwitten genaamd Tribbles. Deze moleculen fungeren als adapters, die de kloof overbruggen tussen een doelwit-eiwit dat verwijderd moet worden en de machinerie die het daadwerkelijk vernietigt. Hoewel deze eiwitten vitaal zijn voor een normale ontwikkeling, is hun defect gelinkt aan ernstige aandoeningen, waaronder bepaalde soorten kanker, waarbij ze gezonde eiwitten te snel kunnen vernietigen of schadelijke eiwitten juist niet kunnen verwijderen. Het begrijpen van de exacte werking van deze adapters, en welke delen van hun structuur essentieel zijn voor hun taak, is een uitdaging geweest omdat wetenschappers geen eenvoudige manier hadden om hen in actie te zien binnen een levend organisme.

Onderzoekers aan de University of Missouri-Kansas City hebben een nieuwe tool ontwikkeld om dit probleem op te lossen, waardoor zij kunnen zien waar en wanneer deze adapterproteïnen actief zijn in een levende fruitvlieg. Ze creëerden een sensor die gloeit met een fluorescent licht, dat dimt wanneer de adapterproteïne correct werkt. Door naar dit licht te kijken, konden ze de activiteit van de adapterproteïne in realtime in kaart brengen en testen welke delen van het eiwit noodzakelijk zijn voor de functie ervan. Hun werk onthulde dat hoewel deze eiwitten een gemeenschappelijke structuur delen over veel dieren heen, het specifieke mechanisme dat zij gebruiken om de vernietigingsmachinerie te rekruteren in fruitvliegen uniek is en aanzienlijk verschilt van de methode die in zoogdieren wordt gebruikt.

De wetenschappers begonnen met het ontwerpen van een sensor gebaseerd op een specifiek doelwit-eiwit dat bekend staat als gecontroleerd door de adapter. In fruitvliegen is dit doelwit een eiwit genaamd Slbo, dat een sleutelrol speelt in de ontwikkeling van de eierstokken. De onderzoekers identificeerden een klein, specifiek deel van het Slbo-eiwit dat fungeert als een signaal voor vernietiging, een regio die de adapterproteïne herkent en aan zich bindt. Ze namen dit signaal en hechtten het aan een fluorescent eiwit, waardoor een hybride molecuul ontstond dat groen of rood gloeit. Onder normale omstandigheden zou dit gloeiende molecuul accumuleren en helder schijnen. Echter, als de adapterproteïne aanwezig en actief was, zou het de het signaal herkennen, het gloeiende molecuul labelen en het naar de vernietiging sturen, waardoor het licht vervaagt. De onderzoekers noemden deze sensor FUTTI, een fluorescente indicator van de turnover-activiteit van de adapter.

Om te testen of deze sensor werkte, introduceerden de onderzoekers deze in fruitvliegen en observeerden zij de gloeiende patronen in hun weefsels. In de ontwikkelende vleugels van de vliegen ontdekten zij dat wanneer de adapterproteïne in grote hoeveelheden aanwezig was, de gloeiende sensor verdween uit die specifieke cellen, wat bevestigde dat de sensor zoals bedoeld werd vernietigd. Omgekeerd, wanneer zij de hoeveelheid van de adapterproteïne verminderden, cumuleerde de sensor en gloeide deze veel helderder. Deze inverse relatie bewees dat de sensor nauwkeurig de activiteitsniveaus van de adapterproteïne in verschillende delen van het lichaam van de vlieg kon rapporteren. Zij zagen vergelijkbare resultaten in de eierstokken, waar de sensor dimde in specifieke cellen waar de adapter actief was, wat aantoonde dat de tool met hoge precisie activiteit in verschillende weefsels in kaart kon brengen.

Met een werkende sensor in handen, ging het team over tot het onderzoeken van de specifieke delen van de adapterproteïne die de werking bepalen. Zij wisten dat de adapterproteïne een centraal gebied heeft dat zich bindt aan het doelwit-signaal en een staartregio die de vernietigingsmachinerie rekruteert. Om het belang van de centrale bindingsregio te testen, creëerden zij een versie van de adapter met een kleine, minimale verandering in de structuur, waarbij één aminozuur werd vervangen door een ander. Wanneer zij dit gewijzigde eiwit in de vliegen tot expressie brachten, bleef de sensor helder en verdween deze niet. Dit resultaat toonde aan dat de centrale bindingsregio essentieel is voor de adapter om het doelwit te herkennen; zonder deze regio kan de adapter de sensor niet grijpen om deze te vernietigen. Interessant genoeg beïnvloedde deze defecte versie van de adapter nog steeds andere cellulaire processen, zoals celdeling, wat suggereert dat verschillende delen van het eiwit verschillende functies aansturen.

De onderzoekers richtten hun aandacht vervolgens op de staart van het eiwit, die verantwoordelijk is voor het rekruteren van de vernietigingsmachinerie. In zoogdieren bevat deze staart een specifieke sequentie die bindt aan een bekend enzym genaamd COP1, dat helpt eiwitten te labelen voor vernietiging. Het team testte of ditzelfde mechanisme ook in fruitvliegen werkte. Eerst probeerden zij te zien of de zoogdierversies van de adapterproteïne in de vlieg konden werken. Zij lieten de muisversies van de adapter tot expressie komen in de vliegen, maar de sensor bleef helder, wat aangaf dat de zoogdierproteïnen de vlieg-sensor niet konden vernietigen. Zelfs toen zij het COP1-enzym van de muis aan de mix toevoegden, slaagden de zoogdieradapters er nog steeds niet in om te werken, wat suggereerde dat de muisproteïnen en de vlieg-sensor incompatibel zijn.

Dit leidte het team ertoe om de unieke structuur van de staart van de fruitvlieg-adapter te onderzoeken. Zij ontdekten dat de fruitvliegversie de specifieke bindingsplaats voor het COP1-enzym mist die in zoogdieren voorkomt. In plaats daarvan heeft het vlieg-eiwit een langere staart met een andere sequentie van aminozuren. Door systematisch delen van deze staart te verwijderen, ontdekten zij dat een specifieke regio, die een korte sequentie van vier aminozuren bevat, cruciaal was voor de functie van het eiwit. Wanneer zij deze specifieke sequentie muteerden, verloor de adapter zijn vermogen om de sensor te vernietigen, en bleef het licht helder. Deze bevinding suggereert dat de fruitvlieg-adapter een uniek mechanisme gebruikt om de vernietigingsmachinerie te rekruteren, een mechanisme dat niet afhankelijk is van het COP1-enzym dat door zoogdieren wordt gebruikt.

De studie benadrukt een fascinerende divergentie in de evolutie. Hoewel de kernfunctie van deze adapterproteïnen — het herkennen van een doelwit en het markeren voor vernietiging — behouden blijft over verschillende dieren heen, zijn de specifieke instrumenten die zij gebruiken om de taak te volbrengen, veranderd. In zoogdieren vertrouwt de adapter op een specifieke interactie met het COP1-enzym. In fruitvliegen heeft de adapter een andere strategie ontwikkeld, waarbij een uniek motief in zijn staart wordt gebruikt om hetzelfde resultaat te bereiken. Deze ontdekking biedt niet alleen een nieuwe tool voor wetenschappers om deze eiwitten in levende organismen te bestuderen, maar verdiept ook ons begrip van hoe moleculaire machinerie verschillende oplossingen kan ontwikkelen voor hetzelfde biologische probleem. De FUTTI-sensor biedt een duidelijke, visuele manier om deze activiteiten te volgen, wat de deur opent naar verder onderzoek naar hoe deze eiwitten de ontwikkeling en ziekten in een breed scala aan soorten beïnvloeden.