RhoBAST-FLIM enables high-fidelity and lifetime-assisted super-resolution RNA imaging
Questo articolo introduce RhoBAST-FLIM, una piattaforma di imaging versatile che sfrutta le differenze di tempo di vita della fluorescenza tra coloranti liberi e legati per ottenere una visualizzazione ad alta fedeltà, con soppressione del fondo e super-risoluzione, di RNA e proteine di superficie cellulare in cellule viventi.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
All'interno di ogni cellula vivente, una vasta biblioteca di istruzioni viene costantemente letta, copiata e spostata per costruire il macchinario della vita. Queste istruzioni sono trasportate da molecole chiamate RNA, che agiscono come messaggeri e gestori all'interno della città microscopica della cellula. Per decenni, gli scienziati hanno lottato per osservare queste molecole di RNA in movimento in tempo reale senza disturbarle. Gli strumenti più comuni per questo compito si basano sul fissare un'etichetta luminosa all'RNA e poi proiettare una luce per vedere dove va. Tuttavia, questo metodo presenta un difetto significativo: l'etichetta luminosa è spesso mescolata con colorante libero, non attaccato, che fluttua liberamente nella cellula. Poiché il colorante libero brilla con la stessa intensità dell'RNA etichettato, crea una nebbia di luce di fondo che rende difficile capire esattamente dove si trova l'RNA o quanto ce n'è presente. È come cercare di individuare una singola candela accesa in una stanza piena di migliaia di altre luci tremolanti; il segnale si perde nel rumore.
Un team di ricercatori dell'Università di Heidelberg ha sviluppato un nuovo modo per farsi strada attraverso questa nebbia, permettendo una visione molto più chiara dell'RNA mentre si muove e funziona all'interno delle cellule viventi. Invece di misurare solo quanto sia brillante la luce, il loro nuovo metodo, chiamato RhoBAST-FLIM, misura quanto a lungo dura la luce dopo che la molecola è stata eccitata. Questa tecnica, nota come imaging del tempo di fluorescenza (fluorescence lifetime imaging), funziona come un cronometro per la luce. Quando la molecola di colorante fluttua liberamente, brilla per un momento brevissimo prima di svanire. Ma quando si lega alla specifica etichetta dell'RNA, il suo bagliore persiste per un tempo sensibilmente più lungo. Misurando questa differenza temporale, i ricercatori possono separare matematicamente il segnale dell'RNA dal rumore di fondo del colorante libero, rivelando la vera posizione dell'RNA con alta precisione.
I ricercatori hanno iniziato progettando una libreria di nuove molecole di colorante basate su una classe di composti chiamati rodamine. Hanno testato molte variazioni per trovare quelle che mostravano la maggiore differenza nel tempo di cui brillavano quando legate all'etichetta dell'RNA rispetto a quando erano libere. Hanno scoperto che certi coloranti modificati, in particolare quelli con specifici gruppi chimici attaccati, si legavano saldamente all'etichetta dell'RNA e cambiavano significativamente la durata del loro bagliore. Alcuni di questi coloranti brillavano per circa 0,9 nanosecondi quando erano liberi, ma si estendevano a oltre 4,5 nanosecondi quando erano attaccati all'RNA. Questa grande differenza ha permesso al sistema di imaging di distinguere chiaramente i due stati, anche quando erano mescolati insieme nello stesso spazio minuscolo.
Utilizzando questi coloranti ottimizzati, il team ha dimostrato di poter immaginiare vari tipi di RNA in cellule umane viventi con un'unica etichetta. Nei metodi precedenti, gli scienziati dovevano spesso attaccare più etichette a una molecola di RNA per renderla abbastanza luminosa da essere vista, il che poteva interferire con il comportamento naturale dell'RNA. Con questo nuovo approccio basato sulla durata (lifetime), un singolo tag era sufficiente perché il sistema poteva ignorare la luce di fondo in modo estremamente efficace. Sono riusciti a tracciare diverse molecole di RNA, incluse quelle che rimangono nel nucleo e altre che si spostano nel citoplasma, dimostrando che il metodo funziona in modo affidabile in diversi ambienti cellulari. I ricercatori hanno scoperto che la durata del bagliore del colorante legato all'RNA rimaneva costante indipendentemente da dove l'RNA fosse situato, provando che il segnale era una firma stabile dell'RNA stesso piuttosto che un artefatto dell'ambiente cellulare circostante.
Oltre a vedere semplicemente dove si trova l'RNA, questa nuova tecnica permette anche l'imaging a super-risoluzione, che rivela dettagli molto più piccoli di quelli che i microscopi standard possono mostrare. I metodi di super-risoluzione standard richiedono spesso fasci di luce intensi per forzare le molecole a spegnersi, il che può danneggiare la cellula o decolorare il colorante. I ricercatori hanno combinato le loro misurazioni del tempo di vita con una tecnica chiamata tauSTED. Questo metodo utilizza la differenza nella durata del bagliore per affinare l'immagine senza la necessità di una potenza così elevata. Quando hanno applicato questo alle molecole di RNA situate in piccole strutture chiamate corpi di Cajal all'interno del nucleo, il nuovo metodo ha rivelato strutture interne intricate che prima erano sfocate o invisibili. Potevano vedere come l'RNA fosse organizzato all'interno di questi compartimenti, mostrando schemi distinti che altre tecniche di imaging non coglievano.
La versatilità di questo approccio è stata ulteriormente dimostrata applicandolo alle proteine sulla superficie delle cellule. Attaccando l'etichetta di riconoscimento dell'RNA a una molecola diversa che riconosce una specifica proteina, i ricercatori potevano usare lo stesso trucco del tempo di vita per immagini delle proteine di superficie cellulare. Hanno scoperto che i coloranti che erano troppo permeabili per l'imaging dell'RNA funzionavano perfettamente qui perché rimanevano all'esterno della cellula, legandosi solo alle proteine di superficie. Ciò ha dimostrato che il metodo poteva essere adattato per diversi target biologici semplicemente cambiando la parte di riconoscimento, mantenendo lo stesso potente sistema di rilevamento del tempo di vita.
Lo studio conferma che misurare la durata della luce, piuttosto che solo la sua luminosità, offre un modo più fedele per osservare il mondo molecolare all'interno delle cellule viventi. Distinguendo tra il colorante legato all'RNA e il colorante libero fluttuante, i ricercatori hanno rimosso una fonte maggiore di incertezza nell'imaging cellulare. Ciò consente agli scienziati di vedere l'RNA e le proteine con maggiore fedeltà e dettagli più nitidi, il tutto utilizzando meno luce per proteggere i delicati sistemi viventi che stanno studiando. Il lavoro stabilisce una nuova piattaforma in cui le proprietà fisiche della luce stessa diventano uno strumento per separare il segnale dal rumore, aprendo la porta all'osservazione della vita dinamica delle cellule con una chiarezza senza precedenti.
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