RhoBAST-FLIM enables high-fidelity and lifetime-assisted super-resolution RNA imaging
यह शोध पत्र RhoBAST-FLIM को प्रस्तुत करता है, जो एक बहुमुखी इमेजिंग प्लेटफॉर्म है जो जीवित कोशिकाओं में RNA और सेल-सरफेस प्रोटीन के उच्च-निष्ठा (high-fidelity), बैकग्राउंड-दमन (background-suppressed) और सुपर-रेज़ोल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन को प्राप्त करने के लिए मुक्त और बंधित रंजक (free and bound dyes) के बीच फ्लोरोसेंस लाइफटाइम अंतर का लाभ उठाता है।
मूल पेपर CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) के तहत लाइसेंस किया गया है। यह एक ऐसे प्रीप्रिंट की AI से तैयार की गई व्याख्या है जिसकी अभी सहकर्मी समीक्षा नहीं हुई है। यह चिकित्सकीय सलाह नहीं है। इस सामग्री के आधार पर स्वास्थ्य संबंधी फैसले न लें। पूरा डिस्क्लेमर पढ़ें
प्रत्येक जीवित कोशिका के भीतर, निर्देशों का एक विशाल पुस्तकालय लगातार पढ़ा, कॉपी और स्थानांतरित किया जा रहा है ताकि जीवन की मशीनरी का निर्माण किया जा सके। ये निर्देश RNA नामक अणुओं द्वारा ले जाए जाते हैं, जो कोशिका के सूक्ष्म शहर के भीतर संदेशवाहकों और प्रबंधकों के रूप में कार्य करते हैं। दशकों से, वैज्ञानिक इन RNA अणुओं को बिना उन्हें बाधित किए वास्तविक समय में चलते हुए देखने के लिए संघर्ष कर रहे हैं। इस कार्य के लिए सबसे सामान्य उपकरण RNA से एक चमकते हुए टैग को जोड़ने और फिर यह देखने के लिए प्रकाश चमकाने पर निर्भर करते हैं कि वह कहाँ जाता है। हालाँकि, इस पद्धति में एक महत्वपूर्ण दोष है: चमकता हुआ टैग अक्सर कोशिका के भीतर स्वतंत्र रूप से तैरते हुए, बिना जुड़े हुए ढीले डाई (dye) के साथ मिल जाता है। क्योंकि ढीली डाई भी टैग्ड RNA की तरह ही चमकती है, यह पृष्ठभूमि प्रकाश का एक कोहरा बना देती है जिससे यह बताना कठिन हो जाता है कि वास्तव में RNA कहाँ है या उसकी मात्रा कितनी है। यह बिल्कुल वैसा ही है जैसे हजारों अन्य टिमटिमाती रोशनी से भरे कमरे में एक अकेली जलती हुई मोमबत्ती को खोजने की कोशिश करना; संकेत शोर में खो जाता है।
हाइडेलबर्ग यूनिवर्सिटी के शोधकर्ताओं की एक टीम ने इस कोहरे को काटने का एक नया तरीका विकसित किया है, जो जीवित कोशिकाओं के भीतर RNA के चलते और कार्य करते हुए अधिक स्पष्ट दृश्य प्रदान करता है। केवल यह मापने के बजाय कि प्रकाश कितना चमकीला है, उनकी नई विधि, जिसे RhoBAST-FLIM कहा जाता है, यह मापती है कि अणु के उत्तेजित होने के बाद प्रकाश कितनी देर तक रहता है। यह तकनीक, जिसे फ्लोरोसेंस लाइफटाइम इमेजिंग (fluorescence lifetime imaging) कहा जाता है, प्रकाश के लिए एक स्टॉपवॉच की तरह काम करती है। जब डाई अणु स्वतंत्र रूपCLE तैर रहा होता है, तो वह फीका पड़ने से पहले बहुत ही संक्षिप्त क्षण के लिए चमकता है। लेकिन जब यह विशिष्ट RNA टैग से जुड़ता है, तो इसकी चमक काफी लंबे समय तक बनी रहती है। इस अंतर को समयबद्ध करके, शोधकर्ता ढीली डाई के बैकग्राउंड शोर से सिग्नल को गणितीय रूप से अलग कर सकते हैं, जिससे उच्च सटीकता के साथ RNA के वास्तविक स्थान का पता चलता है।
शोधकर्ताओं ने नए डाई अणुओं की एक लाइब्रेरी डिजाइन करके शुरुआत की जो रोडामिन (rhodamines) नामक यौगिकों के एक वर्ग पर आधारित थी। उन्होंने उन विविधताओं का परीक्षण किया जो यह दिखाने में सबसे अधिक सक्षम थीं कि वे RNA टैग से बंधे होने और स्वतंत्र होने पर कितनी देर तक चमकते हैं। उन्होंने पाया कि कुछ संशोधित डाई, विशेष रूप से वे जिनमें विशिष्ट रासायनिक समूह जुड़े हुए थे, RNA टैग से मजबूती से बंधते थे और उनकी चमक की अवधि को महत्वपूर्ण रूप से बदलते थे। इनमें से कुछ डाई स्वतंत्र होने पर लगभग 0.9 नैनोसेकंड तक चमकती थीं, लेकिन RNA से जुड़ने पर 4.5 नैनोसेकंड से अधिक समय तक खिंच जाती थीं। इस बड़े अंतर ने इमेजिंग सिस्टम को दो अवस्थाओं को स्पष्ट रूप से पहचानने की अनुमति दी, भले ही वे एक ही सूक्ष्म स्थान में आपस में मिली हुई हों।
इन अनुकूलित डाई का उपयोग करते हुए, टीम ने मानव कोशिकाओं में विभिन्न प्रकार के RNA को एक एकल टैग के साथ प्रदर्शित किया। पिछली विधियों में, वैज्ञानिकों को अक्सर एक RNA अणु को इतना चमकीला बनाने के लिए कई टैग लगाने पड़ते थे कि उसे देखा जा सके, जो RNA के प्राकृतिक व्यवहार में हस्तक्षेप कर सकता था। इस नई लाइफटाइम-आधारित पद्धति के साथ, एक एकल टैग पर्याप्त था क्योंकि सिस्टम बैकग्राउंड लाइट को इतनी प्रभावी ढंग से अनदेखा कर सकता था। उन्होंने विभिन्न प्रकार के RNA को सफलतापूर्वक ट्रैक किया, जिनमें वे भी शामिल थे जो केंद्रक (nucleus) में रहते हैं और वे भी जो साइटोप्लाज्म (cytoplasm) में जाते हैं, जिससे पता चलता है कि यह विधि विभिन्न कोशिकीय वातावरणों में विश्वसनीय रूप से काम करती है। शोधकर्ताओं ने पाया कि RNA-बाउंड डाई की चमक की अवधि इस बात पर निर्भर नहीं थी कि RNA कहाँ स्थित है, जिससे यह सिद्ध हुआ कि सिग्नल कोशिका के परिवेश के बजाय स्वयं RNA का एक स्थिर हस्ताक्षर था।
केवल यह देखने के परे कि RNA कहाँ है, यह नई तकनीक सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की अनुमति भी देती है, जो उन विवरणों को प्रकट करती है जो मानक सूक्ष्मदर्शी देख भी नहीं सकते। मानक सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधियों के लिए अक्सर अणुओं को बंद करने के लिए तीव्र प्रकाश किरणों की आवश्यकता होती है, जो कोशिका को नुकसान पहुँचा सकती हैं या डाई को फीका (bleach) कर सकती हैं। शोधकर्ताओं ने अपने लाइफटाइम माप को tauSTED नामक एक तकनीक के साथ जोड़ा। यह विधि चमक की अवधि के अंतर का उपयोग करके बिना अत्यधिक शक्ति की आवश्यकता के छवि को स्पष्ट करती है। जब उन्होंने इसे केंद्रक के भीतर कैजाल बॉडीज (Cajal bodies) नामक सूक्ष्म संरचनाओं में स्थित RNA अणुओं पर लागू किया, तो नई विधि ने जटिल आंतरिक संरचनाओं को प्रकट किया जो पहले धुंधली या अदृश्य थीं। वे देख सके कि RNA इन कंपार्टमेंट्स के भीतर कैसे व्यवस्थित है, जिससे विशिष्ट पैटर्न दिखाई दिए जिन्हें अन्य इमेजिंग तकनीकें नहीं देख पाईं।
इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा को कोशिका की सतह पर मौजूद प्रोटीन पर इसे लागू करके और भी प्रदर्शित किया गया। RNA-बाइंडिंग टैग को एक अलग अणु से जोड़कर जो एक विशिष्ट प्रोटीन को पहचानता है, शोधकर्ता कोशिका-सतह के प्रोटीन की इमेजिंग के लिए उसी लाइफटाइम ट्रिक का उपयोग कर सके। उन्होंने पाया कि जो डाई RNA इमेजिंग के लिए बहुत पारगम्य (permeable) थीं, वे यहाँ पूरी तरह से काम करती थीं क्योंकि वे कोशिका के बाहर रहती थीं, और केवल सतह के प्रोटीनों से बंधती थीं। इससे पता चला कि इस विधि को पहचान वाले हिस्से को बदलकर अलग-अलग जैविक लक्ष्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जबकि शक्तिशाली लाइफटाइम-डिटेक्शन सिस्टम को समान रखा जा सकता है।
यह अध्ययन पुष्टि करता है कि प्रकाश की चमक के बजाय प्रकाश की अवधि को मापना, जीवित कोशिकाओं के भीतर आणविक दुनिया को देखने का एक अधिक विश्वसनीय तरीका है। RNA-बाउंड डाई और स्वतंत्र रूप से तैरती डाई के बीच अंतर करके, शोधकर्ताओं ने कोशिकीय इमेजिंग में अनिश्चितता के एक प्रमुख स्रोत को हटा दिया है। यह वैज्ञानिकों को उच्च शुद्धता और स्पष्ट विवरण के साथ RNA और प्रोटीन को देखने की अनुमति देता है, और यह सब उन नाजुक जीवित प्रणालियों की रक्षा के लिए कम प्रकाश का उपयोग करते हुए किया जा सकता है जिनका वे अध्ययन कर रहे हैं। यह कार्य एक ऐसा मंच स्थापित करता है जहाँ प्रकाश के भौतिक गुण स्वयं सिग्नल को शोर से अलग करने के उपकरण बन जाते हैं, जो अभूतपूर्व स्पष्टता के साथ कोशिकाओं के गतिशील जीवन को देखने के द्वार खोलता है।
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