RhoBAST-FLIM enables high-fidelity and lifetime-assisted super-resolution RNA imaging
Dit artikel introduceert RhoBAST-FLIM, een veelzijdig beeldvormingsplatform dat het verschil in fluorescentietijd tussen vrije en gebonden kleurstoffen benut om hoogwaardige, achtergrondonderdrukte en superresolutie-visualisatie van RNA en celoppervlakte-eiwitten in levende cellen te bereiken.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
In elke levende cel wordt constant een enorme bibliotheek aan instructies gelezen, gekopieerd en verplaatst om de machinerie van het leven op te bouwen. Deze instructies worden gedragen door moleculen genaamd RNA, die fungeren als boodschappers en beheerders binnen de microscopische stad van de cel. Decennialang hebben wetenschappers geprobeerd om deze RNA-moleculen in realtime te volgen zonder ze te verstoren. De meest gebruikte instrumenten voor deze taak vertrouwen op het bevestigen van een lichtgevende tag aan het RNA en vervolgens licht te schijnen om te zien waar het naartoe gaat. Echter, deze methode heeft een aanzienlijk gebrek: de lichtgevende tag wordt vaak vermengd met losse, niet-bevestigde kleurstof die vrij in de cel zweeft. Omdat de losse kleurstof net zo helder straalt als de getagde RNA, creëert het een mist van achtergrondlicht waardoor het moeilijk is om precies te bepalen waar de RNA zich bevindt of hoeveel ervan aanwezig is. Dit is als proberen een enkele brandende kaars te spotten in een kamer vol met duizenden andere flikkerende lichtjes; het signaal raakt verloren in de ruis.
Een team van onderzoekers aan de Universiteit van Heidelberg heeft een nieuwe manier ontwikkeld om door deze mist heen te snijden, waardoor er een veel helderder beeld ontstaat van hoe RNA beweegt en functioneert in levende cellen. In plaats van alleen te meten hoe helder het licht is, meet hun nieuwe methode, genaamd RhoBAST-FLIM, hoe lang het licht duurt nadat het molecuul is geëxciteerd. Deze techniek, bekend als fluorescentie-levensduurbeeldvorming (fluorescence lifetime imaging), werkt als een stopwatch voor licht. Wanneer de kleurstofmolecuul vrij rondzweeft, geeft het een zeer kort moment licht voordat het vervaagt. Maar wanneer het bindt aan de specifieke RNA-tag, blijft de gloed merkbaar langer aanhouden. Door deze tijdsverschillen te meten, kunnen de onderzoekers het signaal van de RNA wiskundig scheiden van de achtergrondruis van de losse kleurstof, waardoor de werkelijke locatie van de RNA met hoge precisie wordt onthuld.
De onderzoekers begonnen met het ontwerpen van een bibliotheek van nieuwe kleurstofmoleculen gebaseerd op een klasse verbindingen genaamd rhodamines. Ze testten vele variaties om de moleculen te vinden die de grootste verschillen vertoonden in hoe lang ze gloeiden wanneer ze gebonden waren aan de RNA-tag versus wanneer ze vrij waren. Ze ontdekten dat bepaalde gemodificeerde kleurstoffen, met name die met specifieke chemische groepen eraan bevestigd, stevig bonden aan de RNA-tag en de duur van het gloeien aanzienlijk veranderden. Sommige van deze kleurstoffen gloeiden ongeveer 0,9 nanoseconde wanneer ze vrij waren, maar rekten uit tot meer dan 4,5 nanoseconde wanneer ze aan de RNA waren bevestigd. Dit grote verschil stelde het beeldvormingssysteem in staat om de twee toestanden duidelijk van elkaar te onderscheiden, zelfs wanneer ze samen in dezelfde minuscule ruimte gemengd waren.
Met behulp van deze geoptimaliseerde kleurstoffen demonstreerde het team dat ze verschillende soorten RNA in levende menselijke cellen met een enkele tag konden afbeelden. Bij eerdere methoden moesten wetenschappers vaak meerdere tags aan een RNA-molecuul bevestigen om het helder genoeg te maken om te zien, wat het natuurlijke gedrag van de RNA kon verstoren. Met deze nieuwe, op levensduur gebaseerde benadering was een enkele tag voldoende, omdat het systeem het achtergrondlicht zo effectief negeert. Ze slaagden erin om verschillende RNA-moleculen te volgen, waaronder die die in de kern blijven en andere die naar het cytoplasma bewegen, waarmee werd aangetoond dat de methode betrouwbaar werkt in verschillende cellulaire omgevingen. De onderzoekers ontdekten dat de gloeiduur van de aan RNA gebonden kleurstof consistent bleef, ongeacht waar de RNA zich bevond, wat bewees dat het signaal een stabiele handtekening van de RNA zelf was en geen artefact van de omgeving van de cel.
Naast simpelweg zien waar de RNA zich bevindt, maakt deze nieuwe techniek ook super-resolutie beeldvorming mogelijk, wat details onthult die veel kleiner zijn dan wat standaard microscopen kunnen laten zien. Standaard super-resolutie methoden vereisen vaak intense lichtbundels om moleculen te dwingen uit te schakelen, wat de cel kan beschadigen of de kleurstof kan bleken. De onderzoekers combineerden hun levensduurmetingen met een techniek genaamd tauSTED. Deze methode gebruikt het verschil in gloeiduur om het beeld te verscherpen zonder dat er zulke hoge vermogens nodig zijn. Toen ze dit toepasten op RNA-moleculen in kleine structuren genaamd Cajal-lichamen binnen de kern, onthulde de nieuwe methode ingewikkelde interne structuren die voorheen wazig of onzichtbaar waren. Ze konden zien hoe de RNA georganiseerd was binnen deze compartimenten, waarbij ze duidelijke patronen zagen die andere beeldvormingstechnieken misten.
De veelzijdigheid van deze aanpak werd verder aangetoond door het toepassen op eiwitten op het oppervlak van cellen. Door de RNA-bindende tag aan een ander molecuul te bevestigen dat een specifiek eiwit herkent, konden de onderzoekers dezelfde lifetime-truc gebruiken om celoppervlak-eiwitten af te beelden. Ze ontdekten dat kleurstoffen die te permeabel waren voor RNA-beeldvorming perfect werkten voor dit doel, omdat ze buiten de cel bleven en alleen aan de oppervlakte-eiwitten bonden. Dit toonde aan dat de methode kan worden aangepast voor verschillende biologische doelwitten door simpelweg het herkenningsgedeelte van de tag te veranderen, terwijl het krachtige lifetime-detectiesysteem hetzelfde blijft.
De studie bevestigt dat het meten van de duur van het licht, in plaats van alleen de helderheid ervan, een betrouwbaardere manier biedt om de moleculaire wereld binnen levende cellen te observeren. Door onderscheid te maken tussen de aan RNA gebonden kleurstof en de vrij zwevende kleurstof, hebben de onderzoekers een belangrijke bron van onzekerheid in cellulaire beeldvorming weggenomen. Dit stelt wetenschappers in staat om RNA en eiwitten met hogere getrouwheid en scherpere details te zien, terwijl ze minder licht gebruiken om de delicate levende systemen die ze bestuderen te beschermen. Het werk vestigt een nieuw platform waarbij de fysieke eigenschappen van het licht zelf een instrument worden om het signaal van de ruis te scheiden, wat de deur opent naar het observeren van het dynamische leven van cellen met ongekende helderheid.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.