RhoBAST-FLIM enables high-fidelity and lifetime-assisted super-resolution RNA imaging
本文介绍了一种名为 RhoBAST-FLIM 的多功能成像平台，该平台利用游离染料与结合态染料之间的荧光寿命差异，实现了对活细胞内 RNA 和细胞表面蛋白的高保真、背景抑制及超分辨率可视化。
原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。 阅读完整免责声明
在每一个活细胞内部，一个庞大的指令库正在不断地被读取、复制和移动，以构建生命的机器。这些指令由被称为 RNA 的分子携带，它们在细胞这个微观城市中充当着信使和管理者的角色。几十年来，科学家们一直致力于研究如何在不干扰 RNA 分子的前提下，实时观察它们的移动。执行这项任务最常用的工具依赖于在 RNA 上附着一个发光的标签，然后通过照射光线来观察其去向。然而，这种方法有一个显著的缺陷：发光的标签经常会与在细胞内自由漂浮的、未附着的游离染料混合在一起。由于游离的染料也同样明亮地发光，它会产生一层背景光的“雾气”，使得人们很难准确判断 RNA 的确切位置或其含量。这就像是试图在一间充满了成千上万盏闪烁灯光的房间里，寻找一根孤零零的蜡烛；信号会被噪声淹没。
海德堡大学的一个研究团队开发出了一种全新的方法来拨开这层“雾气”，从而能够更清晰地观察活细胞内 RNA 的移动与功能。该方法不再仅仅测量光线的亮度，而是测量分子在被激发后光芒持续的时间。这种被称为荧光寿命成像（FLIM）的技术，其原理就像是光线的“秒表”。当染料分子自由漂浮时，它在褪去光芒前只会闪烁极短的一瞬；但当它与特定的 RNA 标签结合时，其光芒会持续更长的时间。通过测量这一时间差，研究人员可以从游离染料的背景噪声中，通过数学手段将 RNA 的信号分离出来，从而实现对 RNA 位置的高精度定位。
研究人员首先基于一种被称为罗丹明（rhodamines）的化合物类群，设计了一个全新的染料库。他们测试了许多种变体，以寻找那些在结合 RNA 标签与自由状态下，发光时长差异最大的染料。他们发现，某些经过化学改性的染料，特别是那些附带有特定化学基团的染料，能与 RNA 标签紧密结合，并显著改变其发光持续时间。其中一些染料在自由状态下发光时长约为 0.9 纳秒，而一旦附着在 RNA 上，则会延长至 4.5 纳秒以上。这种巨大的差异使得成像系统能够清晰地分辨出两种状态，即使它们混合在同一个微小的空间内。
利用这些经过优化的染料，该团队展示了如何使用单一标签对活人细胞中的各类 RNA 进行成像。在以往的方法中，科学家通常需要为 RNA 分子附着多个标签，以使其足够明亮以便观察，但这可能会干扰 RNA 的自然行为。凭借这种基于寿命的新方法，由于系统能极其有效地忽略背景光，仅需单个标签便已足够。他们成功追踪了包括留在细胞核内以及移动到细胞质中的不同类型的 RNA 分子，证明了该方法在不同细胞环境中均能可靠运行。研究人员发现，无论 RNA 位于何处，其结合染料后的发光时长都保持一致，这证明了该信号是 RNA 本身的稳定特征，而非细胞环境造成的伪影。
除了能观察 RNA 的位置外，这项新技术还实现了超分辨率成像，能够揭示标准显微镜无法看到的更微小的细节。传统的超分辨率方法通常需要强光束来强制分子“关闭”，这可能会损伤细胞或导致染料褪色。研究人员将他们的寿命测量技术与一种称为 tauSTED 的技术相结合。这种方法利用发光持续时间的差异来锐化图像，而无需使用如此高的光功率。当他们将此技术应用于位于细胞核内名为 Cajal 体的微小结构中的 RNA 分子时，新方法揭示了此前模糊或不可见的复杂内部结构。他们能够观察到 RNA 在这些区室内的组织方式，展现出其他成像技术所忽略的独特模式。
该方法的通用性通过将其应用于细胞表面的蛋白质得到了进一步验证。通过将 RNA 结合标签连接到另一种能识别特定蛋白质的分子上，研究人员可以使用同样的“寿命技巧”来对细胞表面蛋白进行成像。他们发现，那些对于 RNA 成像而言渗透性过高的染料，在这里表现得非常完美，因为它们停留在细胞外部，仅与表面蛋白结合。这表明，只要改变识别部分的结构，而保持强大的寿命检测系统不变，该方法就可以通过适配不同的生物靶点来进行调整。
这项研究证实，测量光线的持续时间而非仅仅测量其亮度，是观察活细胞内分子世界的一种更真实可靠的方式。通过区分 RNA 结合染料与游离染料，研究人员消除了细胞成像中的主要不确定性来源。这使得科学家能够以更高的保真度和更清晰的细节来观察 RNA 和蛋白质，同时还能使用较弱的光照来保护脆弱的生命系统。这项工作建立了一个全新的平台，让光本身的物理特性成为了从噪声中提取信号的工具，为以空前的清晰度观察细胞的动态生命开启了大门。
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