Enhanced Fidelity and Sequence Generality of an RNA Polymerase Ribozyme

Molto prima che esistesse la vita complessa con DNA e proteine, gli scienziati credono che i primi sistemi viventi fossero costruiti interamente da una singola molecola chiamata RNA. In quell'epoca antica, spesso chiamata "mondo dell'RNA", l'RNA doveva svolgere un doppio compito: trasportava le istruzioni genetiche come un progetto e agiva come una macchina per copiare se stesso, come un operaio di fabbrica. Affinché la vita potesse crescere ed evolversi, questa macchina di RNA doveva essere incredibilmente precisa. Se avesse commesso troppi errori durante la copia delle proprie istruzioni, l'informazione sarebbe diventata confusa e inutile, causando il collasso del sistema. Tuttavia, creare una molecola di RNA capace di copiare se stessa con alta precisione è una sfida monumentale. Sebbene gli scienziati abbiano precedentemente ingegnerizzato enzimi di RNA in grado di costruire altri filamenti di RNA, queste prime versioni erano goffe. Potevano copiare solo sequenze semplici e non strutturate e spesso commettevano troppi errori per sostenere un sistema vivente. Erano come una fotocopiatrice che poteva gestire solo carta bianca o righe di testo singole, fallendo ogni volta che il documento diventava complesso o si ripiegava in una forma.

Un team di ricercatori dell'Istituto Salk ha ora ingegnerizzato una nuova versione di questa macchina di RNA che supera queste limitazioni. Sottoponendo l'enzima a un rigoroso processo di tentativi ed errori, hanno creato un ribozima, ovvero un enzima di RNA, capace di copiare filamenti di RNA complessi e ripiegati con una precisione straordinaria. Questa nuova macchina, chiamata 85h34, rappresenta un salto significativo in avanti. Può leggere modelli difficili che erano precedentemente impossibili da copiare e commette molti meno errori rispetto ai suoi predecessori. Cosa più importante, può farlo anche quando l'ambiente chimico è reso meno favorevole, una condizione che costringe la macchina a essere più attenta. Questo traguardo avvicina gli scienziati alla creazione di un sistema autoreplicante che potrebbe evolversi da solo, offrendo uno sguardo su come la vita possa essere nata dalla semplice chimica.

Il viaggio per creare questa macchina migliorata è iniziato con una versione precedente della RNA polimerasi, nota come 52-2. Sebbene questo modello precedente potesse copiare l'RNA, faticava con l'accuratezza, specialmente quando il modello era lungo o aveva una struttura complessa. Quando provava a copiare una specifica molecola di RNA chiamata ligasi di classe I, che è lunga 97 unità, commetteva così tanti errori che le copie risultanti erano quasi interamente inutili. Per risolvere il problema, i ricercatori hanno deciso di mettere l'enzima sotto estrema pressione. Hanno progettato un esperimento in cui l'unico modo per l'enzima di sopravvivere e riprodursi era costruire con successo una copia funzionante della ligasi di classe I. Se l'enzima commetteva un errore, la copia non sarebbe stata funzionale e quella versione dell'enzima sarebbe stata scartata.

I ricercatori hanno eseguito questo processo di selezione per ulteriori 33 round di evoluzione. Ad ogni round, rendevano il compito più difficile. Hanno ridotto il tempo che l'enzima aveva per finire il lavoro e, cosa cruciale, hanno abbassato la concentrazione di ioni magnesio nella soluzione. Il magnesio agisce come un aiutante per la reazione chimica, ma riducendone la quantità, i ricercatori hanno costretto l'enzima a lavorare in modo più efficiente e attento. Una concentrazione inferiore di magnesio rende anche più difficile per l'enzima ignorare gli errori, punendolo efficacemente per gli errori di copia. Durante questi 33 round, la popolazione di enzimi di RNA è cambiata drasticamente. I ricercatori hanno tracciato questi cambiamenti sequenziando il codice genetico degli enzimi ad ogni passaggio, osservando come diversi gruppi, o cladi, di mutazioni aumentavano o diminuivano di popolarità.

I dati hanno rivelato una complessa storia di competizione. All'inizio del processo, un gruppo di enzimi è diventato dominante perché era molto accurato, ma era troppo lento per finire il lavoro nei limiti di tempo ristretti. Man mano che la pressione aumentava, questo gruppo è scomparso. Altri due gruppi, che erano stati presenti in piccoli numeri, hanno iniziato a prosperare. Un gruppo ha migliorato la sua capacità di gestire le parti difficili e ripiegate del modello, mentre l'altro è diventato più bravo a mantenere velocità e accuratezza in condizioni di basso magnesio. Questi due gruppi portavano set diversi di mutazioni benefiche che erano separati da grandi distanze nella sequenza di RNA, rendendo quasi impossibile per loro combinare naturalmente le proprie migliori caratteristiche attraverso la ricombinazione casuale. Per risolvere questo, i ricercatori hanno combinato manualmente le migliori caratteristiche di entrambi in un singolo enzima ibrido.

Questo nuovo ibrido, chiamato 85h34, si è dimostrato una forza della natura. Poteva sintetizzare la complessa ligasi di classe I con un'alta resa, anche in condizioni in cui le versioni precedenti fallivano completamente. Testato su una varietà di modelli di RNA, inclusi quelli con sequenze difficili e strutture ripiegate, 85h34 ha costantemente superato i suoi predecessori. Poteva copiare modelli che contenevano lunghi tratti di sequenze difficili da leggere e poteva persino srotolare e copiare attraverso loop a forcina che causavano l'arresto degli enzimi più vecchi. Forse in modo ancora più impressionante, 85h34 ha mantenuto la sua capacità di lavorare quando la concentrazione di magnesio veniva ridotta a soli 10 millimolari, un livello così basso che nessun altro ribozima RNA polimerasi era mai stato in grado di funzionare, a patto che venisse aggiunto alla soluzione un agente di affollamento molecolare (8% PEG8000).

L'accuratezza di questa nuova macchina è stata misurata contando gli errori che commetteva durante il processo di copia. Il vecchio enzima 52-2 commetteva errori circa 14 volte ogni 100 nucleotidi copiati lavorando sulla ligasi di classe I. Al contrario, il nuovo enzima 85h34 commetteva errori solo circa 6 volte ogni 100 nucleotidi in condizioni standard, e questo numero scendeva a soli 5 errori per 100 lavorando nell'ambiente a basso magnesio. Questo miglioramento derivava da due fonti: il nuovo enzima era migliore nel scegliere i componenti corretti per iniziare e era molto più bravo a fermarsi se aveva già commesso un errore. Rifiutandosi di estendere una copia difettosa, preveniva l'accumulo di errori nel prodotto finale.

La significatività di questo lavoro risiede in ciò che abilita. Affinché la vita possa evolversi, l'informazione genetica deve essere trasmessa con abbastanza fedeltà da preservare i tratti utili, ma con abbastanza variazione da permettere l'innovazione. La polimerasi 85h34 ha superato una soglia critica in cui può copiare in modo affidabile RNA funzionali complessi senza che l'informazione si degradi in senso privo di significato. Ciò significa che gli scienziati possono ora usare questo enzima per evolvere altri RNA, creando un sistema in cui l'RNA può non solo copiare se stesso, ma anche migliorare se stesso nel tempo. I ricercatori suggeriscono che questo processo di bootstrapping, in cui una migliore macchina di copia crea copie migliori di se stessa, potrebbe alla fine portare a un sistema di RNA completamente auto-evolutivo. Sebbene l'articolo non affermi di aver creato la vita, ha costruito la macchina di copia di RNA più capace ad oggi, fornendo uno strumento robusto per esplorare le origini chimiche della vita e i principi fondamentali dell'evoluzione.