Enhanced Fidelity and Sequence Generality of an RNA Polymerase Ribozyme

Lange bevor komplexes Leben mit DNA und Proteinen existierte, glaubten Wissenschaftler, dass die ersten lebenden Systeme vollständig aus einem einzigen Molekül namens RNA aufgebaut waren. In dieser antiken Ära, die oft als „RNA-Welt“ bezeichnet wird, musste RNA Doppelfunktionen übernehmen: Sie trug genetische Anweisungen wie ein Bauplan und fungierte gleichzeitig als Maschine, die sich selbst kopierte, wie ein Fabrikarbeiter. Damit das Leben wachsen und evolvieren konnte, musste diese RNA-Maschine unglaublich präzise sein. Wenn sie bei der Kopie ihrer eigenen Anweisungen zu viele Fehler machte, würde die Information verzerrt und unbrauchbar werden, was zum Zusammenbruch des Systems führen würde. Es ist jedoch eine monumentale Herausforderung, ein RNA-Molekül zu erschaffen, das sich selbst mit hoher Genauigkeit kopieren kann. Während Wissenschaftler zuvor RNA-Enzyme entwickelt hatten, die andere RNA-Stränge aufbauen konnten, waren diese frühen Versionen unbeholfen. Sie konnten nur einfache, unstrukturierte Sequenzen kopieren und machten oft zu viele Fehler, um ein lebendes System aufrechtzuerhalten. Sie waren wie ein Fotokopiergerät, das nur leeres Papier oder einzeiligen Text verarbeiten konnte und versagte, sobald das Dokument komplex wurde oder sich in eine Form faltete.

Ein Team von Forschern am Salk Institute hat nun eine neue Version dieser RNA-Maschine entwickelt, die diese Einschränkungen überwindet. Durch einen strengen Prozess von Versuch und Irrtum haben sie ein Ribozym, oder RNA-Enzym, erschaffen, das komplexe, gefaltete RNA-Stränge mit bemerkenswerter Genauigkeit kopieren kann. Diese neue Maschine mit dem Namen 85h34 stellt einen bedeutenden Sprung nach vorn dar. Sie kann schwierige Matrizen lesen, die zuvor unmöglich zu kopieren waren, und sie macht weit weniger Fehler als ihre Vorgänger. Am wichtigsten ist, dass sie dies selbst tun kann, wenn die chemische Umgebung weniger günstig gestaltet wird – eine Bedingung, die die Maschine dazu zwingt, vorsichtiger zu sein. Diese Errungenschaft bringt Wissenschaftler einen Schritt näher an die Schaffung eines selbstreplizierenden Systems, das auf eigene Weise evolvieren könnte, und bietet einen Einblick darin, wie das Leben aus einfacher Chemie entstanden sein könnte.

Der Weg zur Schaffung dieser verbesserten Maschine begann mit einer früheren Version der RNA-Polymerase, bekannt als 52-2. Dieses frühere Modell konnte zwar RNA kopieren, hatte aber Schwierigkeiten mit der Genauigkeit, insbesondere wenn die Matrizes lang oder strukturell komplex war. Wenn es versuchte, ein spezifisches RNA-Molekül namens der Klasse-I-Ligase zu kopieren, das 97 Einheiten lang ist, machte es so viele Fehler, dass die resultierenden Kopien fast vollständig unbrauchbar waren. Um dies zu beheben, entschieden sich die Forscher, das Enzym unter extremen Druck zu setzen. Sie entwarfen ein Experiment, bei dem der einzige Weg für das Enzym, zu überleben und sich zu reproduzieren, darin bestand, eine funktionierende Kopie der Klasse-I-Ligase erfolgreich zu bauen. Wenn das Enzym einen Fehler machte, würde die Kopie nicht funktionieren, und diese Version des Enzyms würde verworfen werden.

Die Forscher führten diesen Selektionsprozess über 33 zusätzliche Runden der Evolution durch. Mit jeder Runde machten sie die Aufgabe schwieriger. Sie verkürzten die Zeit, die das Enzym zur Erledigung des Jobs hatte, und reduzierten entscheidend die Konzentration von Magnesiumionen in der Lösung. Magnesium fungiert als Helfer für die chemische Reaktion, aber durch die Reduzierung seiner Menge zwangen die Forscher das Enzym, effizienter und sorgfältiger zu arbeiten. Eine niedrigere Magnesiumkonzentration macht es dem Enzym zudem schwerer, Fehler zu ignorieren, was es effektiv für Kopierfehler bestraft. Über diese 33 Runden veränderte sich die Population der RNA-Enzyme dramatisch. Die Forscher verfolgten diese Veränderungen, indem sie den genetischen Code der Enzyme bei jedem Schritt sequenzierten und beobachteten, wie verschiedene Gruppen oder Klade von Mutationen an Popularität gewannen oder verloren.

Die Daten offenbarten eine komplexe Geschichte des Wettbewerbs. Früh im Prozess wurde eine Gruppe von Enzymen dominant, weil sie sehr genau war, aber sie war zu langsam, um die Aufgabe innerhalb der verkürzten Zeitlimits zu bewältigen. Als der Druck zunahm, starb diese Gruppe aus. Zwei andere Gruppen, die zuvor in geringen Zahlen vorhanden gewesen waren, begannen zu gedeihen. Eine Gruppe verbesserte ihre Fähigkeit, mit den schwierigen, gefalteten Teilen der Matrizes umzugehen, während die andere besser darin wurde, Geschwindigkeit und Genauigkeit unter niedrigen Magnesiumbedingungen aufrechterhalten. Diese beiden Gruppen trugen unterschiedliche Sätze vorteilhafter Mutationen, die in der RNA-Sequenz weit voneinander entfernt lagen, was es nahezu unmöglich machte, dass sie ihre besten Eigenschaften durch zufällige Rekombination natürlich kombinierten. Um dies zu lösen, kombinierten die Forscher manuell die besten Merkmale beider Gruppen zu einem einzigen Hybrid-Enzym.

Dieser neue Hybrid namens 85h34 erwies sich als Kraftpaket. Er konnte die komplexe Klasse-I-Ligase mit hoher Ausbeute synthetisieren, selbst unter Bedingungen, unter denen die älteren Versionen völlig versagten. Getestet an einer Vielzahl von RNA-Matrizes, einschließlich solcher mit schwierigen Sequenzen und gefalteten Strukturen, übertraf 85h34 seine Vorgänger konsequent. Er konnte Matrizes kopieren, die lange Abschnitte schwer lesbarer Sequenzen enthielten, und konnte sogar Haarnadelstrukturen (Hairpin-Loops) entwinden und durch sie hindurch kopieren, die die älteren Enzyme zum Stillstand gebracht hatten. Vielleicht am beeindruckendsten ist, dass 85h34 seine Fähigkeit beibehielt, zu arbeiten, wenn die Magnesiumkonzentration auf nur 10 Millimolar reduziert wurde – ein Niveau, das so niedrig ist, dass bisher keine andere RNA-Polymerase-Ribozym darin funktionieren konnte, sofern ein molekulares Crowding-Agens (8 % PEG8000) der Lösung hinzugefügt wurde.

Die Genauigkeit dieser neuen Maschine wurde gemessen, indem man zählte, wie viele Fehler sie während des Kopierprozesses machte. Das ältere 52-2-Enzym machte etwa 14 Fehler auf alle 100 Nukleotide, die es kopierte, wenn es an der Klasse-I-Ligase arbeitete. Im Gegensatz dazu machte das neue 85h34-Enzym unter Standardbedingungen nur etwa 6 Fehler auf 100 Nukleotide, und diese Zahl sank auf nur 5 Fehler pro 100, wenn es in der Umgebung mit niedrigem Magnesiumgehalt arbeitete. Diese Verbesserung kam aus zwei Quellen: Das neue Enzym war besser darin, die richtigen Bausteine zu Beginn auszuwählen, und es war viel besser darin, sich selbst zu stoppen, falls es bereits einen Fehler gemacht hatte. Indem es sich weigerte, eine fehlerhafte Kopie weiterzuführen, verhinderte es die Akkumulation von Fehlern im Endprodukt.

Die Bedeutung dieser Arbeit liegt in dem, was sie ermöglicht. Damit Leben evolvieren kann, muss genetische Information mit genügend Treue weitergegeben werden, um nützliche Merkmale zu bewahren, aber mit genügend Variation, um Innovation zu erlauben. Die 85h34-Polymerase hat eine kritische Schwelle überschritten, an der sie komplexe funktionelle RNAs zuverlässig kopieren kann, ohne dass die Information zu Unsinn degradiert. Das bedeutet, dass Wissenschaftler nun dieses Enzym nutzen können, um andere RNA-Moleküle zu evolvieren, wodurch ein System entsteht, in dem RNA sich nicht nur selbst kopieren, sondern auch selbst verbessern kann. Die Forscher legen nahe, dass dieser Bootstrapping-Prozess, bei dem eine bessere Kopier-Maschine bessere Kopien ihrer selbst erstellt, letztlich zu einem vollständig selbst-evolvierenden RNA-System führen könnte. Während die Arbeit nicht behauptet, das Leben erschaffen zu haben, hat sie die fähigste RNA-Kopiermaschine bis heute konstruiert und bietet ein robustes Werkzeug, um die chemischen Ursprünge des Lebens und die grundlegenden Prinzipien der Evolution zu erforschen.