Enhanced Fidelity and Sequence Generality of an RNA Polymerase Ribozyme

Lang voordat complex leven met DNA en eiwitten bestond, geloven wetenschappers dat de eerste levende systemen volledig werden opgebouwd uit één enkel molecuul genaamd RNA. In dit oeroude tijdperk, vaak de "RNA-wereld" genoemd, moest RNA een dubbelrol vervullen: het droeg genetische instructies zoals een blauwdruk, en het fungeerde als een machine om zichzelf te kopiëren, zoals een fabrieksarbeider. Voor het leven om te groeien en te evolueren, moest deze RNA-machine ongelooflijk nauwkeurig zijn. Als het te veel fouten maakte bij het kopiëren van zijn eigen instructies, zou de informatie onleesbaar en nutteloos worden, wat het systeem zou doen instorten. Het is echter een monumentale uitdaging om een RNA-molecuul te creëren dat zichzelf met een hoge nauwkeurigheid kan kopiëren. Hoewel wetenschappers eerder RNA-enzymen hebben ontwikkeld die andere RNA-strengen kunnen bouwen, waren deze vroege versies onhandig. Ze konden alleen eenvoudige, ongestructureerde sequenties kopiëren en maakten vaak te veel fouten om een levend systeem in stand te houden. Ze waren als een fotokopieerapparaat dat alleen blanco papier of regels tekst kon verwerken, en faalde zodra het document complex werd of in een vorm gevouwen was.

Een team onderzoekers van het Salk Institute heeft nu een nieuwe versie van deze RNA-machine ontwikkeld die deze beperkingen overwint. Door het enzym te onderwerpen aan een rigoureus proces van vallen en opstaan, creëerden ze een ribozym, of RNA-enzym, dat complexe, gevouwen RNA-strengen met opmerkelijke nauwkeurigheid kan kopiëren. Deze nieuwe machine, genaamd 85h34, vertegenwoordigt een belangrijke sprong voorwaarts. Het kan moeilijke sjablonen lezen die voorheen onmogelijk te kopiëren waren, en het maakt veel minder fouten dan zijn voorgangers. Het belangrijkste is dat het dit kan doen, zelfs wanneer de chemische omgeving minder gunstig wordt gemaakt, een conditie die de machine dwingt om voorzichtiger te zijn. Deze prestatie brengt wetenschappers een stap dichter bij het creëren van een zelfreplicerend systeem dat op zichzelf kan evolueren, wat een inkijkje biedt in hoe het leven vanuit eenvoudige chemie zou kunnen zijn ontstaan.

De reis naar het creëren van dit verbeterde machine begon met een eerdere versie van de RNA-polymerase, bekend als 52-2. Terwijl dit eerdere model RNA kon kopiëren, worstelde het met nauwkeurigheid, vooral wanneer het sjabloon lang of met een complexe structuur was. Wanneer het probeerde een specifiek RNA-molecuul te kopiëren genaamd de klasse I ligase, dat 97 eenheden lang is, maakte het zoveel fouten dat de resulterende kopieën bijna volledig nutteloos waren. Om dit te oplossen, besloten de onderzoekers het enzym onder extreme druk te zetten. Ze ontwierpen een experiment waarbij de enige manier voor het enzym om te overleven en zich voort te planten, was als het succesvol een werkende kopie van de klasse I ligase bouwde. Als het enzym een fout maakte, zou de kopie niet functioneren, en zou die versie van het enzym worden weggegooid.

De onderzoekers voerden dit selectieproces uit over 33 aanvullende ronden van evolutie. Met elke ronde maakten ze de taak moeilijker. Ze verkortten de tijd die het enzym had om de klus te klaren en, cruciaal, ze verlaagden de concentratie magnesiumionen in de oplossing. Magnesium fungeert als een helper voor de chemische reactie, maar door de hoeveelheid te verminderen, dwongen de onderzoekers het enzym om efficiënter en zorgvuldiger te werken. Een lagere concentratie magnesium maakt het het enzym ook moeilijker om fouten te negeren, wat het effectief straft voor kopieerfouten. Over deze 33 ronden veranderde de populatie RNA-enzymen drastisch. De onderzoekers volgden deze veranderingen door de genetische code van de enzymen bij elke stap te sequensen, waarbij ze zagen hoe verschillende groepen, of clades, van mutaties in populariteit stegen en daalden.

De gegevens onthulden een complexe geschiedenis van competitie. In het begin van het proces werd één groep enzymen dominant omdat deze zeer nauwkeurig was, maar het was te traag om de klus te klaren binnen de verkorte tijdslimieten. Naarmate de druk toenam, stierf deze groep uit. Twee andere groepen, die in kleine aantallen aanwezig waren, begonnen te gedijen. Eén groep verbeterde zijn vermogen om de moeilijke, gevouwen delen van het sjabloon aan te kunnen, terwijl de andere groep beter werd in het behouden van snelheid en nauwkeurigheid onder lage magnesiumomstandigheden. Deze twee groepen droegen verschillende sets gunstige mutaties bij zich die gescheiden waren door grote afstanden in de RNA-sequentie, waardoor het bijna onmogelijk was voor hen om hun beste eigenschappen op natuurlijke wijze te combineren via willekeurige recombinatie. Om dit op te lossen, combineerden de onderzoekers handmatig de beste kenmerken van beide groepen in één enkele, hybride enzym.

Deze nieuwe hybride, genaamd 85h34, bleek een krachtpatser te zijn. Het kon de complexe klasse I ligase met een hoge opbrengst synthetiseren, zelfs in omstandigheden waarin de oudere versies volledig faalden. Wanneer het werd getest op een verscheidenheid aan RNA-sjablonen, inclus�n. die met moeilijke sequenties en gevouwen structuren, presteerde 85h34 consequent beter dan zijn voorgangers. Het kon sjablonen kopiëren die lange stukken moeilijk leesbare sequenties bevatten en kon zelfs door haarpinlussen (hairpin loops) heen ontwinden en kopiëren die de oudere enzymen lieten stagneren. Misschien wel het meest indrukwekkend is dat 85hчно zijn vermogen behield om te werken wanneer de magnesiumconcentratie werd verlaagd tot slechts 10 millimolair, een niveau dat zo laag is dat geen enkele andere RNA-polymerase ribozym ooit heeft kunnen functioneren, mits er een moleculaire crowding-agent (8% PEG8000) aan de oplossing werd toegevoegd.

De nauwkeurigheid van deze nieuwe machine werd gemeten door te tellen hoeveel fouten het maakte tijdens het kopieerproces. Het oudere 52-2 enzym maakte ongeveer 14 fouten per 100 genucleotiden die het kopieerde bij het werken op de klasse I ligase. In tegenstelling hiertoe maakte het nieuwe 85h34 enzym slechts ongeveer 6 fouten per 100 nucleotiden onder standaardomstandigheden, en dit aantal daalde naar slechts 5 fouten per 100 bij het werken in de omgeving met een laag magnesiumgehalte. Deze verbetering kwam voort uit twee bronnen: het nieuwe enzym was beter in het kiezen van de juiste bouwstenen om mee te beginnen, en het was veel beter in het stoppen met doorgaan als het al een fout had gemaakt. Door te weigeren een gebrekkige kopie verder uit te breiden, voorkwam het de accumulatie van fouten in het eindproduct.

De betekenis van dit werk ligt in wat het mogelijk maakt. Voor het leven om te evolueren, moet genetische informatie met voldoende trouw worden doorgegeven om nuttige eigenschappen te behouden, maar met voldoende variatie om innovatie toe te staan. De 85h34 polymerase heeft een kritieke drempel overschreden waarbij het in staat is om complexe functionele RNA's betrouwbaar te kopiëren zonder dat de informatie degradeert tot onzin. Dit betekent dat wetenschappers dit enzym nu kunnen gebruiken om andere RNA-moleculen te laten evolueren, waardoor een systeem ontstaat waarin RNA niet alleen zichzelf kan kopiëren, maar zichzelf ook in de loop van de tijd kan verbeteren. De onderzoekers suggereren dat dit bootstrapping-proces, waarbij een betere kopieermachine betere kopieën van zichzelf maakt, uiteindelijk kan leiden tot een volledig zelf-evoluerend RNA-systeem. Hoewel het artikel niet beweert dat het leven heeft gecreëerd, heeft het de meest capabele RNA-kopieermachine tot nu toe gebouwd, wat een robuust instrument biedt om de chemische oorsprong van het leven en de fundamentele principes van evolutie te verkennen.