Simultaneous Determination of Dapagliflozin and Bisoprolol by LC–MS/MS: Method Development, Validation, and Forced Degradation Studies

Nel complesso mondo della medicina moderna, i medici spesso prescrivono combinazioni di farmaci per gestire condizioni che colpiscono più sistemi del corpo. Per i pazienti che vivono con il diabete di tipo 2 e che affrontano anche l'ipertensione o rischi cardiaci, una specifica coppia di medicinali è diventata uno strumento vitale. Un farmaco aiuta i reni a filtrare lo zucchero in eccesso dal sangue, mentre l'altro lavora per rilassare il cuore e abbassare la pressione sanguigna. Quando questi due medicinali vengono combinati in una singola pillola, offrono un modo snello per trattare entrambe le condizioni contemporaneamente. Tuttavia, prima che una tale pillola possa essere affidata alle milioni di persone, gli scienziati devono dimostrare che gli ingredienti rimangano stabili ed efficaci nel tempo. Devono sapere esattamente quanto di ciascun farmaco sia presente e assicurarsi che il processo di produzione o le condizioni di conservazione non abbiano causato la decomposizione dei medicinali in qualcosa di meno utile o potenzialmente dannoso.

Per garantire questa sicurezza e qualità, i ricercatori si affidano a una tecnica che agisce come una bilancia molecolare altamente sensibile. Questo metodo, noto come cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem, separa una miscela di sostanze chimiche nei suoi singoli componenti e poi li identifica in base al loro peso e alla loro carica elettrica. È un modo potente per esaminare una sostanza complessa e vedere esattamente cosa contiene, fino ai minimi residui. Per molto tempo, gli scienziati hanno dovuto utilizzare strumenti diversi e meno precisi per controllare questi due farmaci specifici separatamente, oppure dovevano affidarsi a metodi che non potevano distinguere chiaramente i farmaci dai loro pezzi degradati. Questa lacuna nella conoscenza significava che il controllo qualità per la pillola combinata non era altrettanto approfondito quanto avrebbe potuto essere.

Un team di ricercatori presso la M. S. Ramaiah University of Applied Sciences in India si è posto l'obiettivo di risolvere questo problema creando un unico metodo altamente preciso per misurare contemporaneamente sia la dapagliflozin che il bisoprololo. Il loro obiettivo era costruire un protocollo di test che potesse non solo contare la quantità di ciascun farmaco in una compressa, ma che fungesse anche da indicatore di stabilità. Ciò significa che il metodo sarebbe stato in grado di individuare se i farmaci avessero iniziato a degradarsi, o a scomponersi, a causa dell'esposizione a condizioni dure come calore, luce o sostanze chimiche. Sviluppando questo nuovo approccio, miravano a fornire uno strumento standard di riferimento per le aziende farmaceutiche per garantire che ogni lotto di queste pillole combinate soddisfi rigorosi requisiti di sicurezza e qualità.

I ricercatori hanno iniziato progettando un sistema in grado di separare i due farmaci mentre scorrono attraverso una minuscola colonna riempita di microsfere. Hanno calibrato attentamente la miscela liquida che trasportava i farmaci attraverso questa colonna, testando diverse combinazioni di acqua, metanolo e sali speciali per trovare l'equilibrio perfetto. I primi tentativi hanno mostrato che i farmaci non si separavano in modo pulito o lasciavano dietro di sé tracce che interferivano con il test successivo. Attraverso un processo di tentativi ed errori, hanno perfezionato la miscela liquida e ridotto la quantità di campione iniettata nella macchina. Questo aggiustamento ha permesso loro di ottenere segnali nitidi e chiari per entrambi i farmaci senza alcuna confusione o residuo lasciato dai test precedenti. La configurazione finale utilizzava una colonna lunga circa quanto una penna standard, riempita di sfere così piccole da poter essere misurate in micrometri, consentendo una separazione molto veloce ed efficiente.

Una volta perfezionata la separazione, il team ha rivolto l'attenzione al sistema di rilevamento, che funge da occhi della macchina. Hanno programmato lo strumento per cercare firme specifiche dei due farmaci mentre uscivano dalla colonna. Per garantire l'accuratezza dei risultati, hanno incluso altri due farmaci simili come punti di riferimento, che hanno aiutato la macchina a correggere qualsiasi minima fluttuazione del processo. I ricercatori hanno poi testato il loro nuovo metodo contro un rigoroso insieme di regole stabilite dalle autorità sanitarie internazionali. Hanno controllato se la macchina potesse rilevare costantemente i farmaci a livelli molto bassi, se i risultati fossero gli stessi ripetendo il test più volte e se il metodo potesse misurare accuratamente i farmaci anche quando le condizioni venivano leggermente modificate, come un piccolo cambiamento di temperatura o di velocità del flusso.

I risultati hanno mostrato che il nuovo metodo era altamente affidabile. Poteva rilevare i farmaci a livelli così bassi di poche centinaia di nanogrammi per millilitro, che è una quantità incredibilmente piccola, e poteva misurarli accuratamente attraverso un'ampia gamma di concentrazioni. Quando i ricercatori hanno testato la precisione del metodo, i risultati sono stati coerenti ogni volta, con pochissima variazione tra i diversi test. Hanno anche controllato l'accuratezza aggiungendo quantità note di farmaci ai campioni e verificando se la macchina riuscisse a trovare esattamente ciò che era stato aggiunto. Il metodo ha trovato le quantità corrette con un alto grado di certezza, dimostrando di poter essere affidato per il controllo qualità di routine.

Una parte critica dello studio ha riguardato il test del comportamento dei farmaci sotto stress, simulando le condizioni dure che potrebbero incontrare durante la produzione o la conservazione. I ricercatori hanno esposto i farmaci a soluzioni acide e basiche, agenti ossidanti forti, calore intenso e luce intensa. Volevano vedere se i farmaci si sarebbero decomposti in queste condizioni e se il loro nuovo metodo sarebbe stato in grado di individuare i pezzi degradati. Lo studio ha rivelato che sia la dapagliflozin che il bisoprololo erano straordinariamente stabili. Anche dopo essere stati sottoposti a questi ambienti stressanti, la stragrande maggioranza dei farmaci è rimasta intatta, con tassi di recupero superiori al novantotto per cento. Fondamentalmente, il metodo non ha rilevato nuovi picchi significativi che potessero indicare la formazione di prodotti di degradazione dannosi. Ciò ha confermato che i farmaci sono robusti e che il nuovo metodo di test è abbastanza sensibile da catturare eventuali problemi, qualora si verificassero.

I ricercatori hanno inoltre testato il metodo su compresse effettive disponibili sul mercato, non solo su polveri chimiche pure. Hanno schiacciato le compresse, sciolto il contenuto e lo hanno fatto passare attraverso il sistema. Il metodo funzionava altrettanto bene sul prodotto finito quanto sugli ingredienti puri, misurando con successo la quantità di ciascun farmaco e confermando che la formulazione della compressa non interferiva con i risultati. Questo è un passaggio vitale, poiché dimostra che il metodo può essere utilizzato in scenari reali per controllare la qualità dei medicinali che i pazienti prenderanno effettivamente. Lo studio ha concluso che questa nuova tecnica è uno strumento robusto, sensibile e affidabile per garantire la qualità di queste pillole combinate. Fornendo un modo chiaro e accurato per misurare entrambi i farmaci simultaneamente e controllarne la stabilità, i ricercatori hanno offerto una risorsa preziosa per mantenere la sicurezza e l'efficacia di un trattamento che aiuta milioni di persone a gestire la propria salute.