Simultaneous Determination of Dapagliflozin and Bisoprolol by LC–MS/MS: Method Development, Validation, and Forced Degradation Studies

No complexo mundo da medicina moderna, os médicos frequentemente prescrevem combinações de medicamentos para gerir condições que afetam múltiplos sistemas do corpo. Para pacientes que vivem com diabetes tipo 2 e que também enfrentam hipertensão ou riscos cardíacos, um emparelhamento específico de medicamentos tornou-se uma ferramenta vital. Um fármaco ajuda os rins a filtrar o excesso de açúcar do sangue, enquanto o outro trabalha para relaxar o coração e baixar a pressão arterial. Quando estes dois medicamentos são combinados numa única pílula, oferecem uma forma simplificada de tratar ambas as condições ao mesmo tempo. No entanto, antes que tal pílula possa ser confiada por milhões de pessoas, os cientistas devem provar que os ingredientes permanecem estáveis e eficazes ao longo do tempo. Eles precisam de saber exatamente quanto de cada fármaco está presente e garantir que o processo de fabrico ou as condições de armazenamento não causaram a degradação dos medicamentos para algo menos útil ou potencialmente prejudicial.

Para garantir esta segurança e qualidade, os investigadores dependem de uma técnica que atua como uma balança molecular altamente sensível. Este método, conhecido como cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa sequencial, separa uma mistura de produtos químicos nos seus componentes individuais e depois os identifica pelo seu peso e carga elétrica. É uma forma poderosa de observar uma substância complexa e ver exatamente o que está lá dentro, até às quantidades de traço mais ínfimas. Durante muito tempo, os cientistas tiveram de usar ferramentas diferentes e menos precisas para verificar estes dois fármacos separadamente, ou tiveram de confiar em métodos que não conseguiam distinguir claramente os fármacos das suas partes degradadas. Esta lacuna no conhecimento significava que o controlo de qualidade para a pílula combinada não era tão minucioso quanto poderia ser.

Uma equipa de investigadores da M. S. Ramaiah University of Applied Sciences, na Índia, estabeleceu o objetivo de resolver isto, criando um método único e altamente preciso para medir tanto a dapagliflozina como o bisoprolol ao mesmo tempo. O seu objetivo era construir um protocolo de teste que pudesse não só contar a quantidade de cada fármaco num comprimido, mas também atuar como um indicador de estabilidade. Isto significa que o método seria capaz de detetar se os fármacos tinham começado a degradar-se, ou a partir-se, devido à exposição a condições adversas como calor, luz ou produtos químicos. Ao desenvolver esta nova abordagem, visavam fornecer uma ferramenta de padrão de ouro para as empresas farmacêuticas garantirem que cada lote destas pílulas combinadas cumpre rigorosos requisitos de segurança e qualidade.

Os investigadores começaram por desenhar um sistema que pudesse separar os dois fármacos à medida que fluíam através de uma pequena coluna preenchida com esferas microscópicas. Ajustaram cuidadosamente a mistura líquida que transportava os fármacos através desta coluna, testando diferentes combinações de água, metanol e sais especiais para encontrar o equilíbrio perfeito. As tentativas iniciais mostraram que os fármacos não se separavam de forma limpa ou deixavam vestígios que interferiam no teste seguinte. Através de um processo de tentativa e erro, refinaram a mistura líquida e reduziram a quantidade de amostra injetada na máquina. Este ajuste permitiu-lhes obter sinais nítidos e claros para ambos os fármacos sem qualquer confusão ou resíduo restante de testes anteriores. A configuração final utilizou uma coluna que tinha aproximadamente o comprimento de uma caneta padrão, preenchida com esferas tão pequenas que poderiam ser medidas em micrômetros, permitindo uma separação muito rápida e eficiente.

Uma vez aperfeiçada a separação, a equipa voltou a sua atenção para o sistema de deteção, que atua como os olhos da máquina. Programaram o instrumento para procurar assinaturas específicas dos dois fármacos à medida que estes saíam da coluna. Para garantir que os resultados fossem precisos, incluíram outros dois fármacos semelhantes como pontos de referência, o que ajudou a máquina a corrigir quaisquer pequenas flutuações no processo. Os investigadores testaram o seu novo método contra um conjunto rigoroso de regras estabelecidas pelas autoridades de saúde internacionais. Verificaram se a máquina conseguia detetar consistentemente os fármacos em níveis muito baixos, se os resultados eram os mesmos quando o teste era repetido várias vezes e se o método conseguia medir com precisão os fármacos mesmo quando as condições eram ligeiramente alteradas, como uma pequena mudança de temperatura ou velocidade de fluxo.

Os resultados mostraram que o novo método era altamente fiável. Conseguia detetar os fármacos em níveis tão baixos como algumas centenas de nanogramas por mililitro, o que é uma quantidade incrivelmente pequena, e conseguia medi-los com precisão numa ampla gama de concentrações. Quando os investigadores testaram a precisão do método, os resultados foram consistentes em todas as vezes, com uma variação muito pequena entre os diferentes testes. Também verificaram a exatidão ao adicionar quantidades conhecidas dos fármacos às amostras e observando se a máquina encontrava exatamente o que fora adicionado. O método encontrou as quantidades corretas com um elevado grau de certeza, provando que poderia ser confiado para o controlo de qualidade de rotina.

Uma parte crítica do estudo envolveu testar como os fármacos se comportavam sob stress, simulando as condições adversas que poderiam enfrentar durante a fabricação ou o armazenamento. Os investigadores expuseram os fármacos a soluções ácidas e básicas, agentes oxidantes fortes, calor intenso e luz brilhante. Queriam ver se os fármacos se degradariam nestas condições e se o seu novo método conseguiria detetar as partes partidas. O estudo revelou que tanto a dapagliflozina como o bisoprolol eram notavelmente estáveis. Mesmo após serem submetidos a estes ambientes de stress, a grande maioria dos fármacos permaneceu intacta, com taxas de recuperação acima de noventa e oito por cento. Crucialmente, o método não detetou quaisquer novos picos significativos que indicassem a formação de produtos de degradação prejudiciais. Isto confirmou que os fármacos são robustos e que o novo método de teste é sensível o suficiente para captar quaisquer problemas potenciais, mesmo que estes ocorressem.

Os investigadores também testaram o método em comprimidos reais disponíveis no mercado, não apenas em pós químicos puros. Esmagaram os comprimidos, dissolveram o conteúdo e passaram-os pelo sistema. O método funcionou tão bem no produto acabado como nos ingredientes puros, medindo com sucesso a quantidade de cada fármaco e confirmando que a formulação do comprimido não interferiu nos resultados. Este é um passo vital, pois prova que o método pode ser utilizado em cenários do mundo real para verificar a qualidade dos medicamentos que os pacientes realmente tomarão. O estudo concluiu que esta nova técnica é uma ferramenta robusta, sensível e fiável para garantir a qualidade destas pílulas combinadas. Ao fornecer uma forma clara e precisa de medir ambos os fármacos simultaneamente e verificar a sua estabilidade, os investigadores ofereceram um recurso valioso para manter a segurança e a eficácia de um tratamento que ajuda milhões de pessoas a gerir a sua saúde.