Response Surface Methodology-Based Optimization, Purification and Biochemical Characterization of Uricase and Peroxidase for Colorimetric Uric Acid Detection

In alto nel corpo umano, una molecola chiamata acido urico agisce come un naturale prodotto di scarto, il residuo derivante dalla scomposizione di certi alimenti e cellule. Per la maggior parte delle persone, i reni filtrano questa sostanza in modo efficiente. Ma quando i livelli salgono troppo, l'eccesso può cristallizzarsi, portando a una condizione dolorosa nota come gotta, o contribuendo ad altri problemi metabolici. Per mantenere la salute sotto controllo, i medici devono misurare quanto acido urico galleggia nel sangue. Il modo standard per farlo si affida a un ingegnoso trucco biologico: l'uso di due enzimi specifici come una squadra. Un primo enzima, chiamato uricasi, agisce come un lavoratore specializzato che scompone l'acido urico. Mentre svolge il suo lavoro, produce accidentalmente una piccola quantità di perossido di idrogeno. Un secondo enzima, la perossidasi, cattura quindi quel perossido di idrogeno e lo usa per innescare un cambiamento di colore in un colorante chimico. Più scuro è il colore blu che appare, maggiore era l'acido urico originariamente presente nel campione. Questo metodo è affidabile, ma dipende dall'avere una fornitura costante di questi due enzimi, che può essere costosa o difficile da produrre in grandi quantità.

Un ricercatore presso l'Università di Agricoltura di Faisalabad, in Pakistan, si è posto l'obiettivo di migliorare questo processo rendendo gli enzimi stessi più efficienti e più facili da ottenere. Si è concentrato su due fonti distinte. Per l'uricasi, si è rivolto a un comune batterio del suolo chiamato Bacillus subtilis, un organismo microscopico che produce naturalmente l'enzima. Per la perossidasi, ha guardato alla pianta di rafano, una radice molto nota per contenere alti livelli di questa specifica proteina. La sfida non era solo trovare questi enzimi, ma convincere i batteri e le radici delle piante a produrli nelle quantità più elevate possibili, e poi a pulirli affinché fossero abbastanza puri per i test medici.

Il ricercatore ha iniziato coltivando la sua coltura batterica in un brodo liquido, ma sapeva che lasciare semplicemente crescere i batteri non fosse sufficiente. Le condizioni del liquido — quanto fosse acido o basico, quanto fosse caldo, per quanto tempo li avesse lasciati riposare e quanto starter batterico avesse aggiunto — avrebbero tutti cambiato la quantità di enzima prodotta dai batteri. Per trovare la miscela perfetta, ha utilizzato uno strumento statistico chiamato metodologia della superficie di risposta. Invece di testare una condizione alla volta, il che può ignorare come diversi fattori lavorino insieme, questo approccio ha permesso di mappare un panorama di possibilità. Ha eseguito ventisette esperimenti diversi, modificando la temperatura, l'acidità, il tempo e il volume dello starter della coltura. I risultati hanno rivelato un punto ottimale: i batteri producevano la maggiore quantità di uricasi quando il liquido veniva mantenuto con una leggera acidità, scaldato a quaranta gradi Celsius e lasciato incubare per ventiquattro ore con una specifica quantità di starter della coltura. Sotto queste precise condizioni, i batteri producevano una quantità di enzima significativamente superiore rispetto a prima.

Hanno applicato lo stesso approccio rigoroso alle radici di rafano. Estrarre la perossidasi dalla pianta richiedeva di bilanciare l'acidità del liquido, la temperatura, il tempo di immersione delle radici e la concentrazione di perossido di idrogeno utilizzata durante il processo. Anche in questo caso, il modello statistico li ha guidati verso un insieme ideale di condizioni: un ambiente leggermente acido, una temperatura fresca di trenta gradi Celsius, un breve tempo di estrazione di trenta minuti e una specifica concentrazione di perossido di idrogeno. Questa combinazione ha prodotto la massima quantità di perossidasi attiva dal tessuto vegetale.

Una volta prodotti questi enzimi in quantità ottimizzate, la fase successiva era la purificazione. Il brodo liquido e l'estratto vegetale erano pieni di altre proteine e detriti che avrebbero interferito con il test. Il ricercatore ha utilizzato una serie di passaggi per isolare i due enzimi. Per prima cosa, ha aggiunto sale alla miscela per far sì che gli enzimi si raggruppassero e precipitassero dal liquido, un processo che ha rimosso una grande parte del materiale indesiderato. Successivamente, ha fatto passare la miscela attraverso una colonna di sfere cariche che agivano come un setaccio, catturando gli enzimi e lasciando passare le altre proteine. Infine, ha fatto passare il campione attraverso una colonna di filtrazione per gel, che ha selezionato le proteine in base alla dimensione. Questo attento processo di pulizia ha funzionato bene. Per l'uricasi batterica, il prodotto finale era più di tre volte più puro della miscela iniziale, con una parte significativa dell'attività originale conservata. Anche la perossidasi vegetale ha visto un notevole aumento di purezza, diventando quasi due volte più pura dell'estratto grezzo.

Con gli enzimi puri in mano, il ricercatore ha testato come si comportassero. Ha scoperto che entrambi gli enzimi funzionavano meglio a una temperatura di quaranta gradi Celsius, che è piacevolmente calda ma non tanto da danneggiarli. Ha anche scoperto che gli enzimi avevano preferenze specifiche per l'acidità: l'uricasi funzionava meglio in un ambiente leggermente alcalino, mentre la perossidasi preferiva un ambiente da neutro a leggermente alcalino. Il ricercatore ha anche controllato quanto durassero gli enzimi se conservati. Ha scoperto che mantenere gli enzimi congelati a meno venti gradi Celsius preservava la loro attività molto meglio rispetto al mantenerli in un frigorifero standard a quattro gradi Celsius. Dopo due mesi, gli enzimi congelati mantenevano ancora la maggior parte del loro potere, mentre quelli refrigerati avevano perso una quantità significativa.

Infine, il ricercatore ha messo alla prova i suoi enzimi purificati in uno scenario reale. Ha mescolato l'uricasi e la perossidasi con un colorante blu e li ha aggiunti a campioni di siero ematico umano. Il sistema ha funzionato esattamente come previsto. Man mano che l'acido urico nel sangue veniva scomposto, il colorante diventava blu e l'intensità del colore corrispondeva alla quantità di acido urico presente. Il test mostrava una linea retta e affidabile tra la quantità di acido urico e l'intensità del colore, funzionando accuratamente attraverso un ampio intervallo di concentrazioni. Quando ha confrontato i suoi risultati con le misurazioni cliniche standard, i numeri corrispondevano da vicino, con pochissimo errore. Lo studio ha concluso che, ottimizzando attentamente il modo in cui questi enzimi vengono coltivati ed estratti, e purificandoli efficacemente, è possibile creare uno strumento altamente accurato e conveniente per misurare l'acido urico. Questo approccio offre un'alternativa pratica per i contesti medici, particolarmente nei luoghi in cui i kit di test commerciali costosi potrebbero essere difficili da reperire.