Response Surface Methodology-Based Optimization, Purification and Biochemical Characterization of Uricase and Peroxidase for Colorimetric Uric Acid Detection

No alto do corpo humano, uma molécula chamada ácido úrico atua como um resíduo natural, os detritos restantes da decomposição de certos alimentos e células. Para a maioria das pessoas, os rins filtram essa substância de forma eficiente. Mas quando os níveis sobem demais, o excesso pode cristalizar, levando a uma condição dolorosa conhecida como gota, ou contribuindo para outros problemas metabólicos. Para manter a saúde sob controle, os médicos precisam medir quanto ácido úrico está flutuando no sangue. A forma padrão de fazer isso baseia-se em um truque biológico inteligente: usar dois tipos específicos de enzimas como uma equipe. Uma enzima, chamada uricase, atua como um trabalhador especializado que decompõe o ácido úrico. À medida que realiza seu trabalho, ela produz acidentalmente uma pequena quantidade de peróxido de hidrogênio. Uma segunda enzima, a peroxidase, então agarra esse peróxido de hidrogênio e o utiliza para desencadear uma mudança de cor em um corante químico. Quanto mais escuro for o azul que aparece, mais ácido úrico havia originalmente na amostra. Este método é confiável, mas depende de ter um suprimento constante dessas duas enzimas, que podem ser caras ou difíceis de produzir em grandes quantidades.

Um pesquisador da Universidade de Agricultura de Faisalabad, no Paquistão, partiu para melhorar este processo, tornando as próprias enzimas mais eficientes e fáceis de obter. Eles focaram em duas fontes distintas. Para a uricase, recorreram a uma bactéria comum do solo chamada Bacillus subtilis, um organismo microscópico que produz naturalmente a enzima. Para a peroxidase, olharam para a planta do rabanete (horseradish), uma raiz de vegetais bem conhecida por conter altos níveis desta proteína específica. O desafio não era apenas encontrar essas enzimas, mas induzir as bactérias e as raízes das plantas a produzi-las na maior quantidade possível e, depois, limpá-las para que fossem puras o suficiente para testes médicos.

O pesquisador começou cultivando sua cultura bacteriana em um caldo líquido, mas sabia que simplesmente deixar as bactérias crescerem não era suficiente. As condições do líquido — quão ácido ou básico era, quão quente estava, quanto tempo as deixavam repousar e quanto do iniciador bacteriano eles adicionavam — mudariam a quantidade de enzima que as bactérias produziam. Para encontrar a mistura perfeita, eles usaram uma ferramenta estatística chamada metodologia de superfície de resposta. Em vez de testar uma condição de cada vez, o que pode ignorar como diferentes fatores trabalam juntos, esta abordagem permitiu que mapeassem um cenário de possibilidades. Eles realizaram vinte e sete experimentos diferentes, ajustando a temperatura, a acidez, o tempo e o volume do iniciador da cultura. Os resultados revelaram um ponto ideal: as bactérias produziam a maior quantidade de uricase quando o líquido era mantido com uma acidez suave, aquecido a quarenta graus Celsius e deixado para incubar por vinte e quatro horas com uma quantidade específica de iniciador de cultura. Sob estas condições precisas, as bactérias produziram uma quantidade significativamente maior da enzima do que haviam produzido anteriormente.

Eles aplicaram a mesma abordagem rigorosa às raízes de rabanete. Extrair a peroxidase da planta exigia equilibrar a acidez do líquido, a temperatura, o tempo de imersão das raízes e a concentração de peróxido de hidrogênio usada durante o processo. Novamente, o modelo estatístico os guiou para um conjunto ideal de condições: um ambiente levemente ácido, uma temperatura fresca de trinta graus Celsius, um curto tempo de extração de trinta minutos e uma concentração específica de peróxido de hidrogênio. Esta combinação rendeu a maior quantidade de peroxidase ativa do tecido vegetal.

Uma vez que as enzimas foram produzidas nestas quantidades otimizadas, o próximo obstáculo foi a purificação. O caldo líquido e o extrato vegetal estavam cheios de outras proteínas e detritos que interfeririam no teste. O pesquisador utilizou uma série de etapas para isolar as duas enzimas. Primeiro, adicionou sal à mistura para fazer com que as enzimas se agrupassem e caíssem do líquido, um processo que removeu uma grande parte do material indesejado. Em seguida, passou a mistura por uma coluna de esferas carregadas que agiam como um crivo, capturando as enzimas enquanto deixavam outras proteínas passarem. Finalmente, passou a amostra por uma coluna de filtração em gel, que classificava as proteínas pelo tamanho. Este cuidadoso processo de limpeza funcionou bem. Para a uricase bacteriana, o produto final foi mais de três vezes mais puro do que a mistura inicial, com uma parte significativa da atividade original retida. A peroxidase vegetal também teve um aumento notável na pureza, tornando-se quase duas vezes mais pura que o extrato bruto.

Com as enzimas puras em mãos, o pesquisador testou como elas se comportavam. Ele descobriu que ambas as enzimas funcionam melhor a uma temperatura de quarenta graus Celsius, que é confortavelmente quente, mas não quente o suficiente para danificá-las. Ele também descobriu que as enzimas tinham preferências específicas de acidez; a uricase funcionava melhor em um ambiente levemente alcalino, enquanto a peroxidase preferia um ambiente neutro a levemente alcalino. O pesquisador também verificou quanto tempo as enzimas durariam se armazenadas. Ele descobriu que manter as enzimas congeladas a menos vinte graus Celsius preservava sua atividade muito melhor do que mantê-las em um refrigerador padrão a quatro graus Celsius. Após dois meses, as enzimas congeladas ainda mantinham a maior parte de seu poder, enquanto as refrigeradas haviam perdido uma quantidade significativa.

Finalmente, o pesquisador colocou suas enzimas purificadas à prova em um cenário do mundo real. Ele misturou a uricase e a peroxidase com um corante azul e as adicionou a amostras de soro sanguíneo humano. O sistema funcionou exatamente como previsto. À medida que o ácido úrico no sangue era decomposto, o corante tornava-se azul, e a intensidade da cor correspondia à quantidade de ácido úrico presente. O teste mostrou uma linha reta e confiável entre a quantidade de ácido úrico e a intensidade da cor, funcionando com precisão através de uma ampla gama de concentrações. Quando compararam seus resultados com medições clínicas padrão, os números coincidiram de perto, com muito pouco erro. O estudo concluiu que, ao otimizar cuidadosamente como essas enzimas são cultivadas e extraídas, e depois purificá-las efetivamente, é possível criar uma ferramenta altamente precisa e de baixo custo para medir o ácido úrico. Esta abordagem oferece uma alternativa prática para ambientes médicos, particularmente em locais onde kits de teste comerciais caros podem ser difíceis de obter.