Response Surface Methodology-Based Optimization, Purification and Biochemical Characterization of Uricase and Peroxidase for Colorimetric Uric Acid Detection

En lo alto del cuerpo humano, una molécula llamada ácido úrico actúa como un desecho natural, los restos de la descomposición de ciertos alimentos y células. Para la mayoría de las personas, los riñones filtran esta sustancia de manera eficiente. Pero cuando los niveles suben demasiado, el exceso puede cristalizarse, provocando una condición dolorosa conocida como gota, o contribuyendo a otros problemas metabólicos. Para mantener la salud bajo control, los médicos necesitan medir cuánto ácido úrico flota en la sangre. La forma estándar de hacer esto se basa en un ingenioso truco biológico: usar dos enzimas específicas como un equipo. Una enzima, llamada uricasa, actúa como un trabajador especializado que descompone el ácido úrico. Mientras hace su trabajo, produce accidentalmente una pequeña cantidad de peróxido de hidrógeno. Una segunda enzima, la peroxidasa, toma entonces ese peróxido de hidrógeno y lo utiliza para desencadenar un cambio de color en un tinte químico. Cuanto más oscuro sea el color azul que aparece, más ácido úrico había originalmente en la muestra. Este método es confiable, pero depende de tener un suministro constante de estas dos enzimas, las cuales pueden ser costosas o difíciles de producir en grandes cantidades.

Un investigador de la Universidad de Agricultura de Faisalabad en Pakistán se propuso mejorar este proceso haciendo que las propias enzimas sean más eficientes y fáciles de obtener. Se centró en dos fuentes distintas. Para la uricasa, recurrió a una bacteria común del suelo llamada Bacillus subtilis, un organismo microscópico que produce la enzima de forma natural. Para la peroxidasa, buscó en la planta de rábano picante (horseradish), una raíz de verdura bien conocida por contener altos niveles de esta proteína específica. El desafío no era solo encontrar estas enzimas, sino coaccionar a las bacterias y a las raíces de las plantas para que produjeran estas enzimas en las mayores cantidades posibles, y luego limpiarlas para que fueran lo suficientemente puras para las pruebas médicas.

El investigador comenzó cultivando su cultivo bacteriano en un caldo líquido, pero sabía que simplemente dejar crecer a las bacterias no era suficiente. Las condiciones del líquido —qué tan ácido o básico era, qué tan cálido estaba, cuánto tiempo las dejaban reposar y cuánto de la cultura iniciadora de bacterias añadían— cambiarían la cantidad de enzima que las bacterias producían. Para encontrar la mezcla perfecta, utilizó una herramienta estadística llamada metodología de superficie de respuesta. En lugar de probar una condición a la vez, lo que puede pasar por alto cómo interactúan diferentes factores, este enfoque les permitió mapear un paisaje de posibilidades. Realizaron veinte y siete experimentos diferentes, ajustando la temperatura, la acidez, el tiempo y el volumen del cultivo iniciador. Los resultados revelaron un punto ideal: las bacterias producían la mayor cantidad de uricasa cuando el líquido se mantenía con una acidez leve, se calentaba a cuarenta grados Celsius y se dejaba incubar durante veinticuatro horas con una cantidad específica de cultivo iniciador. Bajo estas condiciones precisas, las bacterias produjeron una cantidad significativamente mayor de la enzima que antes.

Aplicaron el mismo enfoque riguroso a las raíces de rábano picante. Extraer la peroxidasa de la planta requería equilibrar la acidez del líquido, la temperatura, el tiempo de remojo de las raíces y la concentración de peróxido de hidrógeno utilizada durante el proceso. Nuevamente, el modelo estadístico los guio hacia un conjunto ideal de condiciones: un ambiente ligeramente ácido, una temperatura fresca de treinta grados Celsius, un corto tiempo de extracción de treinta minutos y una concentración específica de peróxido de hidrógeno. Esta combinación produjo la mayor cantidad de peroxidasa activa del tejido vegetal.

Una vez que las enzimas se produjeron en estas cantidades optimizadas, el siguiente obstáculo fue la purificación. El caldo líquido y el extracto de la planta estaban llenos de otras proteínas y desechos que interferirían con la prueba. El investigador utilizó una serie de pasos para aislar las dos enzimas. Primero, añadieron sal a la mezcla para que las enzimas se agruparan y cayeran del líquido, un proceso que eliminó una gran parte del material no deseado. Después, pasaron la mezcla a través de una columna de perlas cargadas que actuaban como un tamiz, atrapando las enzimas mientras dejaban pasar otras proteínas. Finalmente, pasaron la muestra por una columna de filtración en gel, que clasificaba las proteínas por tamaño. Este cuidadoso proceso de limpieza funcionó bien. Para la uricasa bacteriana, el producto final fue más de tres veces más puro que la mezcla inicial, manteniendo una parte significativa de la actividad original. La peroxidasa vegetal también experimentó un notable aumento en su pureza, volviéndose casi dos veces más pura que el extracto crudo.

Con las enzimas puras en mano, el investigador probó cómo se comportaban. Encontró que ambas enzimas funcionan mejor a una temperatura de cuarenta grados Celsius, que es cómodamente cálida pero no lo suficientemente caliente como para dañarlas. También descubrieron que las enzimas tenían preferencias específicas de acidez; la uricasa funcionaba mejor en un ambiente ligeramente alcalino, mientras que la peroxidasa prefería un entorno neutro a ligeramente alcalino. El investigador también comprobó cuánto tiempo durarían las enzimas si se almacenaban. Encontró que mantener las enzimas congeladas a menos veinte grados Celsius preservaba su actividad mucho mejor que mantenerlas en un refrigerador estándar a cuatro grados Celsius. Después de dos meses, las enzimas congeladas aún conservaban la mayor parte de su potencia, mientras que las refrigeradas habían perdido una cantidad significativa.

Finalmente, el investigador puso sus enzimas purificadas a prueba en un escenario del mundo real. Mezclaron la uricasa y la peroxidasa con un tinte azul y lo añadieron a muestras de suero sanguíneo humano. El sistema funcionó exactamente como se predijo. A medida que el ácido úrico en la sangre se descomponía, el tinte se volvía azul, y la intensidad del color coincidía con la cantidad de ácido úrico presente. La prueba mostró una línea recta y confiable entre la cantidad de ácido úrico y la intensidad del color, trabajando con precisión a través de un amplio rango de concentraciones. Cuando compararon sus resultados con las mediciones clínicas estándar, los números coincidieron estrechamente, con muy poco error. El estudio concluyó que, al optimizar cuidadosamente cómo se cultivan y extraen estas enzimas, y luego purificarlas eficazmente, es posible crear una herramienta altamente precisa y rentable para medir el ácido úrico. Este enfoque ofrece una alternativa práctica para entornos médicos, particularmente en lugares donde los kits de prueba comerciales costosos podrían ser difíciles de conseguir.