Ultrahigh-Throughput Evolution of a Photoenzyme for Efficient Bioproduction of Toluene and p-Cresol

La natura si è a lungo affidata alla luce solare per alimentare la vita, più famosamente attraverso la fotosintesi, dove le piante catturano l'energia luminosa per costruire zuccheri. Ma la luce fa molto di più che nutrire il mondo verde; può anche guidare reazioni chimiche all'interno di minuscole macchine biologiche chiamate enzimi. Questi enzimi alimentati dalla luce, noti come fotoenzimi, agiscono come strumenti alimentati dal sole che possono scomporre o costruire molecole con una velocità incredibile. Per anni, gli scienziati hanno cercato di riaddestrare queste macchine naturali per svolgere nuovi compiti, come trasformare materiali di origine vegetale in sostanze chimiche utili che attualmente produciamo dal petrolio. Tuttavia, un grande ostacolo si è frapposto: trovare la versione giusta di un enzima che funzioni abbastanza bene da essere utile. Il processo di miglioramento di un enzima comporta solitamente la creazione di migliaia di minuscole modifiche alla sua struttura e il test di esse una per una, un lavoro lento e tedioso che spesso lascia i ricercatori con solo modesti miglioramenti.

Un team di ricercatori ha ora superato questo collo di bottiglia creando un metodo per testare milioni di variazioni enzimatiche in un singolo giorno. Si sono concentrati su un particolare enzima alimentato dalla luce che scompone naturalmente gli acidi grassi. Gli scienziati volevano insegnare a questo enzima a fare qualcosa che non ha mai fatto in natura: convertire determinati componenti strutturali di origine vegetale in toluene e p-cresolo. Queste due sostanze chimiche sono ingredienti vitali per la benzina, la plastica e gli antiossidanti, ma sono attualmente prodotte quasi interamente dal petrolio. Utilizzando una nuova tecnica di screening ultra-rapida, il team è riuscito a far evolvere l'enzima per svolgere questo nuovo compito con alta efficienza. Hanno poi collegato questo enzima migliorato ad altri passaggi biologici, creando un sistema completo in grado di trasformare zuccheri semplici derivati dal mais o da altri raccolti direttamente in queste preziose sostanze chimiche, offrendo una potenziale via per sostituire la produzione basata sul petrolio con un'alternativa più pulita e rinnovabile.

La sfida è iniziata con l'estrema difficoltà di trovare un ago in un pagliaio. Per rendere un enzima migliore in un nuovo compito, gli scienziati creano tipicamente una libreria di versioni mutanti, ognuna con lievi differenze nella propria struttura. In passato, i ricercatori potevano testare solo poche centinaia o migliaia di questi mutanti alla volta, il che è come cercare un libro specifico in una biblioteca controllando solo pochi scaffali. Il team ha capito che per trovare una versione veramente superiore, dovevano cercare tra milioni di possibilità. Per farlo, hanno costruito un sistema di sensori biologici. Hanno progettato una specifica proteina che funge da rilevatore, la quale brilla intensamente quando rileva la sostanza chimica bersaglio, il toluene o il p-cresolo. Questo bagliore funge da segnale che l'enzima all'interno della cellula sta lavorando correttamente. Collegando questo segnale luminoso a una macchina capace di smistare le cellule a velocità incredibili, hanno creato un sistema in grado di scansionare milioni di cellule in poche ore, selezionando solo quelle che producevano il bagliore più forte.

I ricercatori hanno applicato questo screening ad alta velocità a una libreria di milioni di variazioni dell'enzima degli acidi grassi. Hanno iniziato introducendo piccole modifiche mirate alla struttura dell'enzima basate su previsioni informatiche, e poi hanno utilizzato cambiamenti casuali per esplorare ancora più possibilità. Nel primo round di screening, hanno identificato alcuni candidati promettenti che erano migliori nel compito rispetto all'enzima originale. Ma non si sono fermati lì. Hanno preso i migliori candidati e li hanno sottoposti nuovamente al processo di screening, aggiungendo più mutazioni e testandoli sotto condizioni ancora più rigorose. Dopo tre round di questa intensa evoluzione, hanno isolato due versioni finali dell'enzima che erano più di duecento volte più produttive rispetto all'originale. Queste nuove versioni potevano convertire i materiali di partenza di origine vegetale in toluene e p-cresolo con una velocità e un'efficienza straordinarie, raggiungendo numeri di turnover che non erano mai stati visti prima per questo tipo di reazione su sostanze non native.

Per capire come queste minuscole modifiche abbiano fatto una differenza così grande, il team ha utilizzato simulazioni al computer per osservare l'enzima in azione. Hanno scoperto che le mutazioni lavoravano insieme per rimodellare la tasca interna dell'enzima dove avviene la reazione chimica. La nuova forma rendeva la tasca più piccola e oleosa, il che aiutava a trattenere più saldamente le molecole vegetali. Le mutazioni hanno anche regolato la distanza tra la parte dell'enzima che assorbe la luce e la sostanza chimica che cercava di scomporre, rendendo il trasferimento di energia molto più veloce. Essenzialmente, il processo evolutivo aveva perfezionato la meccanica interna dell'enzima, ottimizzando ogni passaggio, da come la sostanza chimica entrava nell'enzima a come veniva trasformata e rilasciata.

Con questi potenti nuovi enzimi in mano, i ricercatori si sono posti l'obiettivo di costruire una linea di produzione completa. Hanno progettato un processo multi-stadio in cui un set di batteri converte prima gli amminoacidi, derivati dagli zuccheri, in intermedi chimici. Successivamente, i nuovi enzimi evoluti tramite la luce prendono il controllo, utilizzando la luce blu per rimuovere un atomo di carbonio e rilasciare il prodotto finale. In un ambiente di laboratorio, questo sistema ha prodotto con successo alte concentrazioni di toluene e p-cresolo. Il team ha poi portato il processo un passo oltre, combinandolo con un processo di fermentazione su larga scala. Hanno fatto crescere i batteri in un grande serbatoio per produrre direttamente gli amminoacidi necessari dal glucosio e, senza fermarsi per purificare la miscela, hanno alimentato direttamente la reazione a base di luce con questa "zuppa" grezza. Il risultato è stato un flusso continuo che ha convertito lo zucchero vegetale grezzo in 4,3 grammi di toluene e 21,4 grammi di p-cresolo per litro di liquido.

Questo lavoro dimostra che è possibile riprogrammare gli strumenti naturali alimentati dalla luce per eseguire compiti industriali complessi che prima erano considerati fuori portata. Combinando un metodo di screening rapido con la modellazione al computer e la fermentazione, il team ha mostrato una via chiara per produrre sostanze chimiche importanti da biomassa rinnovabile invece che da combustibili fossili. Il successo di questo approccio suggerisce che altre trasformazioni chimiche difficili potrebbero essere risolte in modo simile, aprendo potenzialmente la porta a una vasta gamma di processi manifatturieri sostenibili che si basano sulla luce solare e sulla biologia piuttosto che sul petrolio e sull'alto calore. Lo studio conferma che, con gli strumenti giusti, il limite di ciò che questi enzimi possono fare è molto più alto di quanto precedentemente immaginato.