Ultrahigh-Throughput Evolution of a Photoenzyme for Efficient Bioproduction of Toluene and p-Cresol

De natuur heeft lang vertrouwd op zonlicht om het leven aan te drijven, het meest bekend via fotosynthese, waarbij planten lichtenergie vastleggen om suikers op te bouwen. Maar licht doet meer dan alleen de groene wereld voeden; het kan ook chemische reacties aansturen binnen minuscule biologische machines die enzymen worden genoemd. Deze op licht werkende enzymen, bekend als foto-enzymen, fungeren als op zonne-energie werkende gereedschappen die moleculen met ongelooflijke snelheid kunnen afbreken of opbouwen. Jarenlang hebben wetenschappers geprobeerd deze natuurlijke machines te hertrainen om nieuwe taken uit te voeren, zoals het omzetten van plantaardige materialen in nuttige chemicaliën die we momenteel uit olie maken. Echter, een grote hindernis stond in de weg: het vinden van de juiste versie van een enzym die goed genoeg werkt om nuttig te zijn. Het proces van het verbeteren van een enzym houdt meestal in dat er duizenden minuscule veranderingen in de structuur worden aangebracht en deze één voor één worden getest, een traag en tijdrovend werk dat onderzoekers vaak slechts met bescheiden verbeteringen achterlaat.

Een team van onderzoekers heeft nu deze flessenhals overwonnen door een methode te ontwikkelen om miljoenen enzymvariaties in een enkele dag te testen. Ze concentreerden zich op een specifiek op licht werkend enzym dat van nature vetzuren afbreekt. De wetenschappers wilden dit enzym leren iets te doen wat het in de natuur nooit heeft gedaan: bepaalde plantaardige bouwstenen omzetten in tolueen en p-cresol. Deze twee chemicaliën zijn vitale ingrediënten in benzine, plastics en antioxidanten, maar ze worden momenteel bijna volledig geproduceerd uit aardolie. Door gebruik te maken van een nieuwe, ultrasnelle screeningsmethode, slaagde het team erin om het enzym te evolueren om deze nieuwe taak met hoge efficiëntie uit te voeren. Ze koppelden dit verbeterde enzym vervolgens aan andere biologische stappen, waardoor een compleet systeem ontstond dat eenvoudige suikers uit maïs of andere gewassen direct kan omzetten in deze waardevolle chemicaliën, wat een potentieel pad biedt om de oliegebaseerde productie te vervangen door een schoner, hernieuwbaar alternatief.

De uitdaging begon met de enorme moeilijkheid van het zoeken naar een speld in een hooiberg. Om een enzym beter te maken in een nieuwe taak, maken wetenschappers doorgaans een bibliotheek van mutante versies aan, die elk kleine verschillen in hun structuur hebben. In het verleden konden onderzoekers slechts een paar honderd of een paar duizend van deze mutanten tegelijk testen, wat vergelijkbaar is met het zoeken naar een specifiek boek in een bibliotheek door slechts enkele planken te controleren. Het team realiseerde zich dat ze, om een werkelijk superieure versie te vinden, door miljoenen mogelijkheden moesten zoeken. Om dit te doen, bouwden ze een biologisch sensorsysteem. Ze ontwierpen een specifiek eiwit dat fungeert als een detector, die helder oplicht wanneer het de doelchemische stof, tolueen of p-cresol, detecteert. Dit licht geven dient als een signaal dat het enzym in de cel correct werkt. Door dit lichtgevende signaal te koppelen aan een machine die cellen met ongelooflijke snelheid kan sorteren, creëerden ze een systeem dat miljoenen cellen in enkele uren kon scannen en alleen de cellen selecteerde die de sterkste gloed produceerden.

De onderzoekers pasten deze hogesnelheidsscreening toe op een bibliotheek van miljoenen variaties van het vetzuur-enzym. Ze begonnen met het aanbrengen van kleine, gerichte veranderingen in de structuur van het enzym op basis van computervoorspellingen, en gebruikten vervolgens willekeurige veranderingen om nog meer mogelijkheden te verkennen. In de eerste ronde van de screening identificeerden ze een paar veelbelovende kandidaten die beter waren in de taak dan het oorspronkelijke enzym. Maar ze stopten daar niet. Ze namen de beste kandidaten en lieten deze opnieuw door het screeningsproces gaan, waarbij ze meer mutaties toevoegden en ze onder nog strengere omstandigheden testten. Na drie ronden van deze intense evolutie isoleerden ze twee definitieve versies van het enzym die meer dan tweehonderd keer productiever waren dan het oorspronkelijke enzym. Deze nieuwe versies konden de plantaardige beginmaterialen met opmerkelijke snelheid en efficiëntie omzetten in tolueen en p-cresol, waarbij ze omzettingscijfers bereikten die nooit eerder waren gezien voor dit type reactie op niet-natuurlijke chemicaliën.

Om te begrijpen hoe deze kleine veranderingen zo'n groot verschil maakten, gebruikten het team computersimulaties om het enzym in actie te observeren. Ze ontdekten dat de mutaties samenwerkten om de interne holte van het enzym, waar de chemische reactie plaatsvindt, te hervormen. De nieuwe vorm maakte de holte kleiner en olieachtiger, wat hielp om de plantaardige moleculen steviger vast te grijpen. De mutaties pasten ook de afstand aan tussen het lichtabsorberende deel van het enzym en de chemische stof die het probeerde af te breken, waardoor de energietransfer veel sneller verliep. In essentie had het evolutieproces de interne machinerie van het enzym fijn afgesteld, waarbij elke stap werd geoptimaliseerd, van hoe de chemische stof het enzym binnenging tot hoe deze werd getransformeerd en vrijgegeven.

Met deze krachtige nieuwe enzymen in handen, zetten de onderzoekers zich in om een volledige productielijn op te zetten. Ze ontwierpen een proces met meerdere stappen waarbij een set bacteriën eerst aminozuren, die afgeleid zijn van suikers, omzet in intermediaire chemicaliën. Vervolgens nemen de nieuw geëvolueerde, op licht werkende enzymen het over, waarbij ze blauw licht gebruiken om een koolstofatoom te verwijderen en het eindproduct vrij te geven. In een laboratoriumsetting produceerde dit systeem succesvol hoge concentraties tolueen en p-cresol. Het team ging vervolgens een stap verder door dit te combineren met een grootschalig fermentatieproces. Ze kweekten bacteriën in een grote tank om de benodigde aminozuren direct uit glucose te produceren, en voedden deze ruwe soep vervolgens, zonder de mengeling te zuiveren, rechtstreeks aan de op licht werkende reactie. Het resultaat was een continue stroom die de ruwe plantaardige suiker omzette in 4,3 gram tolueen en 21,4 gram p-cresol per liter vloeistof.

Dit werk demonstreert dat het mogelijk is om de licht-werkende instrumenten van de natuur te herprogrammeren om complexe industriële taken uit te voeren die voorheen als onbereikbaar werden beschouwd. Door een snelle screeningsmethode te combineren met computermodellering en fermentatie, heeft het team een duidelijk pad aangetoond voor de productie van belangrijke chemicaliën uit hernieuwbare biomassa in plaats van fossiele brandstoffen. Het succes van deze aanpak suggereert dat andere moeilijke chemische transformaties op een vergelijkbare manier kunnen worden opgelost, wat potentieel de deur opent naar een breed scala aan duurzame productieprocessen die vertrouwen op zonlicht en biologie in plaats van olie en hoge hitte. De studie bevestigt dat met de juiste instrumenten het plafond voor wat deze enzymen kunnen doen, veel hoger ligt dan men voorheen had kunnen vermoeden.