Ultrahigh-Throughput Evolution of a Photoenzyme for Efficient Bioproduction of Toluene and p-Cresol

자연은 오랫동안 태양광에 의존하여 생명력을 유지해 왔으며, 가장 유명한 사례는 식물이 빛 에너지를 포착하여 당을 만드는 광합성입니다. 하지만 빛은 단순히 녹색 세계를 먹여 살리는 데 그치지 않고, 효소라고 불리는 아주 작은 생물학적 기계 내부의 화학 반응을 구동할 수도 있습니다. 이러한 빛 기반 효소인 광합성 효소(photoenzymes)는 태양광으로 작동하는 도구처럼 작용하여 분자를 놀라운 속도로 분해하거나 합성할 수 있습니다. 수년 동안 과학자들은 이 자연적인 기계들을 새로운 과업을 수행하도록 재훈련시키려 노력해 왔습니다. 예를 들어, 식물 기반의 재료를 현재 우리가 석유로부터 만드는 유용한 화학 물질로 전환하는 것과 같은 작업입니다. 그러나 하나의 큰 장애물이 가로막고 있었습니다. 바로 적절하게 작동할 만큼 충분히 유용한 버전의 효소를 찾는 것이었습니다. 효소를 개선하는 과정은 보통 구조에 수천 개의 미세한 변화를 주고 이를 하나씩 테스트하는 과정을 포함하는데, 이는 매우 느리고 지루한 작업이며 종종 연구자들에게 미미한 수준의 개선만을 남기곤 합니다.

한 연구팀이 단 하루 만에 수백만 개의 효소 변이를 테스트할 수 있는 방법을 개발함으로써 이 병목 현상을 극복했습니다. 그들은 지방산을 분해하는 특정 빛 기반 효소에 집중했습니다. 과학자들은 이 효소가 자연 상태에서는 결코 해본 적 없는 일, 즉 특정 식물 기반 구성 성분을 톨루엔(toluene)과 p-크레졸(p-cresol)로 전환하도록 가르치고자 했습니다. 이 두 화학 물질은 가솔린, 플라스틱, 항산로제의 핵심 성분이지만, 현재는 거의 전적으로 석유로부터 생산됩니다. 연구팀은 새로운 초고속 스크리닝 기술을 사용하여 이 효소가 새로운 과업을 높은 효율로 수행하도록 진화시키는 데 성공했습니다. 그 후, 그들은 이 개선된 효소를 다른 생물학적 단계들과 연결하여, 단순한 옥수수나 기타 작물의 당을 이러한 가치 있는 화학 물질로 직접 전환할 수 있는 완전한 시스템을 구축했습니다. 이는 석유 기반 생산을 더 깨끗하고 재생 가능한 대안으로 대체할 수 있는 잠재적인 경로를 제공합니다.

도전은 마치 건초더미에서 바늘을 찾는 것과 같은 엄청난 어려움에서 시작되었습니다. 효소를 새로운 과업에 더 능숙하게 만들기 위해, 과학자들은 보통 구조에 약간의 차이를 둔 돌연변이 버전의 라이브러리를 만듭니다. 과거에 연구자들은 한 번에 수백 또는 수천 개의 돌연변이만을 테스트할 수 있었는데, 이는 이는 도서관에서 몇 개의 선반만을 확인하며 특정 책을 찾는 것과 같습니다. 연구팀은 진정으로 우수한 버전을 찾기 위해서는 수백만 개의 가능성을 탐색해야 한다는 것을 깨달았습니다. 이를 위해 그들은 생물학적 센서 시스템을 구축했습니다. 그들은 타겟 화학 물질인 톨루엔이나 p-크레졸을 감지할 때 밝게 빛나는 탐지기 역할을 하는 특정 단백질을 설계했습니다. 이 빛은 세포 내부의 효소가 제대로 작동하고 있다는 신호 역할을 합니다. 이 빛나는 신호를 초고속으로 세포를 분류할 수 있는 기계와 연결함으로써, 연구팀은 단 몇 시간 만에 수백만 개의 세포를 스캔하여 가장 강한 빛을 내는 세포만을 골라낼 수 있는 시스템을 만들었습니다.

연구진은 이 고속 스크리닝 기법을 지방산 효소의 수백만 가지 변이 라이브러리에 적용했습니다. 그들은 먼저 컴퓨터 예측을 바탕으로 효소 구조에 작고 표적화된 변화를 주었으며, 그 후 더 많은 가능성을 탐색하기 위해 무작위적인 변화를 사용했습니다. 첫 번째 스크리닝 라운드에서 그들은 원래의 효소보다 해당 작업에 더 뛰어난 몇 가지 유망한 후보들을 식별했습니다. 하지만 거기서 멈추지 않았습니다. 그들은 가장 좋은 후보들을 가져와 더 많은 돌연변이를 추가하고 더 엄격한 조건에서 다시 스크리닝 과정을 거쳤습니다. 이 강도 높은 진화의 세 차례 라운드를 거친 끝에, 그들은 원래보다 200배 이상 생산성이 높은 두 가지 최종 효소 버전을 분리해 냈습니다. 이 새로운 버전들은 식물 기반의 출발 물질을 놀라운 속도와 효율로 톨루엔과 p-크레졸로 전환할 수 있었으며, 이와 같은 종류의 비천연 화학 물질에 대해 이전에 본 적 없는 전환율을 달お성했습니다.

이러한 미세한 변화가 어떻게 그토록 큰 차이를 만들어냈는지 이해하기 위해, 팀은 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여 효소가 작동하는 모습을 관찰했습니다. 그들은 돌연변이들이 화학 반응이 일어나는 효소 내부의 포켓(pocket) 형상을 재구성함으로써 함께 작용한다는 것을 발견했습니다. 새로운 형태는 포켓을 더 작고 기름지게 만들었는데, 이는 식물 기반 분자를 더 단단하게 붙잡는 데 도움을 주었습니다. 또한 돌연변이들은 빛을 흡수하는 효소 부분과 분해하려는 화학 물질 사이의 거리를 조정하여 에너지 전달을 훨씬 빠르게 만들었습니다. 본질적으로 진화 과정은 화학 물질이 효소로 들어오는 방식부터 변형되고 방출되는 방식까지 모든 단계를 최적화하여 효소의 내부 기계 장치를 미세하게 조정했습니다.

이 강력한 새로운 효소들을 손에 넣은 연구진은 완전한 생산 라인을 구축하기 위해 나섰습니다. 그들은 한 세트의 박테리아가 먼저 당으로부터 유래한 아미노산을 중간 화학 물질로 전환하는 다단계 공정을 설계했습니다. 그다음, 새로 진화한 빛 기반 효소들이 청색광을 사용하여 탄소 원자를 제거하고 최종 생성물을 방출하는 역할을 맡습니다. 실험실 환경에서 이 시스템은 톨루엔과 p-크레졸을 고농도로 생산하는 데 성공했습니다. 연구팀은 여기서 한 걸음 더 나아가 대규모 발효 공정과 결합했습니다. 그들은 커다란 탱크에서 박테리아를 배양하여 포도당으로부터 필요한 아미노산을 직접 생산하게 했고, 혼합물을 정제하는 과정 없이 이 조제품(crude soup)을 빛 기반 반응에 직접 투입했습니다. 그 결과, 식물 당을 리터당 4.3g의 톨루엔과 21.4g의 p-크레졸로 전환하는 연속적인 흐름이 만들어졌습니다.

이 연구는 자연의 빛 기반 도구들을 프로그래밍하여 이전에는 도달할 수 없다고 생각되었던 복잡한 산업적 과업을 수행하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다. 빠른 스크리닝 방법과 컴퓨터 모델링, 그리고 발효를 결합함으로써, 연구팀은 화석 연료 대신 재생 가능한 바이오매스로 중요한 화학 물질을 생산하는 명확한 경로를 제시했습니다. 이 접근 방식의 성공은 다른 어려운 화학적 변환들도 유사한 방식으로 해결될 수 있음을 시사하며, 이는 석유와 고열 대신 태양광과 생물학에 의존하는 광범위한 지속 가능한 제조 공정의 문을 열어줄 수 있습니다. 이 연구는 적절한 도구가 있다면 이 효소들이 할 수 있는 능력의 한계가 우리가 이전에 상상했던 것보다 훨씬 높다는 것을 확인시켜 줍니다.