Functional dissection of ultraconserved non-coding regions present near the Hoxd complex in vertebrates
Questo studio utilizza l'editing genomico CRISPR-Cas9 nel pesce zebra per dimostrare che, sebbene le sequenze ultraconservate centrali all'interno delle regioni CR2 e CR3 del complesso Hoxd siano sviluppatamentali indispensabili e letali quando eliminate, la loro rimozione non altera significativamente l'espressione dei geni Hoxd o lo sviluppo morfologico macroscopico, suggerendo che questi elementi possano funzionare attraverso una sottile repressione trascrizionale o meccanismi ridondanti.
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Nel profondo del codice genetico di ogni animale vertebrato, dai pesci agli esseri umani, risiede un insieme di istruzioni che funge da architetto principale per il corpo. Queste istruzioni, note come geni Hox, determinano dove finisce la testa e dove inizia la coda, e dettano la formazione di arti e organi interni. Sebbene i geni stessi siano ben compresi, gli spazi tra di essi sono riempiti di misteriosi sequenze di DNA non codificante che non producono proteine, ma agiscono invece come interruttori, dimmer e segnali di stop per controllare quando e dove i geni Hox si attivano. Tra queste sequenze si trovano gli elementi ultraconservati, tratti di DNA che sono rimasti quasi perfettamente invariati per centinaia di milioni di anni di evoluzione. La loro estrema stabilità suggerisce che siano vitali, eppure gli scienziati hanno a lungo faticato a spiegare esattamente cosa facciano, poiché la rimozione di essi in esperimenti precedenti lasciava spesso gli animali completamente normali. Questo paradosso ha lasciato un vuoto nella nostra comprensione di come la vita costruisca se stessa.
Un team di ricercatori presso il CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology in India si è posto l'obiettivo di risolvere questo mistero concentrandosi su tre specifiche regioni altamente conservate situate vicino al complesso del gene Hoxd nello zebrafish. Queste regioni, che gli scienziati chiamano CR1, CR2 e CR3, sono più lunghe di 200 paia di basi e sono quasi identiche tra esseri umani, topi e pesci. Per comprenderne la vera funzione, i ricercatori hanno utilizzato uno strumento di editing genetico preciso per tagliare via queste regioni dal genoma dello zebrafish, creando una serie di pesci con diverse parti mancanti. Hanno testato tutto, dal delezionare l'intera regione alla rimozione di piccole sottosezioni, sperando di vedere se i pesci si sarebbero sviluppati con pinne mancanti, spine distorte o altri difetti visibili.
I risultati hanno rivelato una netta divisione tra ciò che è essenziale e ciò che è opzionale. Quando i ricercatori hanno tentato di eliminare le parti centrali, le più altamente conservate di CR2 e CR3, o la combinazione di entrambe, le modifiche genetiche sono state così gravi che i pesci non potevano sopravvivere fino all'età adulta. Queste specifiche delezioni non sono mai state trasmesse alla generazione successiva, indicando che queste sequenze centrali sono indispensabili per la vita. Tuttavia, quando il team ha rimosso una sezione più piccola e meno conservata di 626 paia di basi dal bordo di CR2, ha creato con successo una linea stabile di pesci che cresceva sana e fertile. Questi pesci non mostravano differenze visibili rispetto ai loro simili normali; i loro corpi si formavano correttamente, i loro scheletri erano intatti e le loro pinne si sviluppavano normalmente.
Nonostante la mancanza di difetti fisici, i ricercatori hanno guardato più da vicino a livello molecolare per vedere se la parte mancante avesse un effetto sottile. Hanno esaminato l'attività dei geni Hoxd nei pesci mutanti e hanno scoperto che i geni venivano ancora attivati nei posti giusti al momento giusto. Tuttavia, una misurazione sensibile della quantità totale di attività genetica ha mostrato un aumento molto lieve e costante dell'espressione di questi geni nei pesci mutanti rispetto a quelli normali. Ciò suggerisce che la sezione eliminata agisca normalmente come un freno molto debole, rallentando leggermente l'attività dei geni Hoxd. Senza questo freno, i geni corrono un po' più velocemente, ma l'aumento non è abbastanza grande da causare un problema visibile nel corpo del pesce.
Lo studio ha anche scoperto che queste regioni conservate non sono solo interruttori statici, ma vengono trascritte attivamente in molecole di RNA, un tipo di messaggero genetico. Queste molecole di RNA appaiono precocemente durante lo sviluppo e si trovano in tutto l'embrione prima di stabilizzarsi in aree specifiche della testa e del cervello. I ricercatori propongono che queste molecole di RNA possano aiutare a regolare i geni Hoxd vicini, possibilmente legandosi al proprio DNA per perfezionare il sistema. Le scoperte suggeriscono che l'estrema conservazione di queste sequenze di DNA non sia dovuta al fatto che tutte siano ugualmente critiche per la sopravvivenza in ogni contesto, ma perché il nucleo di queste regioni contiene istruzioni non negoziabili per la vita, mentre i bordi circostanti forniscono un perfezionamento che può essere più critico per i mammiferi complessi che per i pesci. Questo lavoro chiarisce che, sebbene alcune parti del genoma siano così vitali che la loro perdita sia fatale, altre parti ultraconservate svolgono un ruolo più sottile, agendo come regolatori precisi che mantengono il progetto del corpo in funzione senza causare una crisi se vengono leggermente alterate.
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