Functional dissection of ultraconserved non-coding regions present near the Hoxd complex in vertebrates

技術的要約：Hoxd複合体近傍の超保存非コード領域の機能的分離

問題提起
超保存非コード要素（UCE）は、脊椎動物のゲノム間でほぼ完璧な配列保存性を示しており、これは深刻な進化上の制約と不可欠な生物学的機能を示唆している。軸形成および肢の形態形成のマスターレギュレーターである脊椎動物のHoxd複合体の近傍において、3つの特定の保存領域（CR1、CR2、CR3）が特定されている。これらの領域は200 bpよりも長く、ヒト、マウス、ラットのゲノム間で例外的な配列保存性を示している。一過性のレポーターアッセイにより、これらの領域が強力な調節活性（エンハンサーまたはリプレッサーとして機能する）を持つことが示されているが、それらの正確なin vivoにおける機能、標的遺伝子、および作用メカニズムは未解決のままである。分野における中心的な問いは、これらの要素が普遍的に不可欠であるのか、あるいは、一部のUCEの欠失が顕著な表現型を伴わない生存可能な個体をもたらしたマウスでの先行研究を考慮すると、機能的な冗長性を示すのかという点である。

方法論
本研究では、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）モデル系を用いたバイオインフォマティクスと遺伝学のデュアルアプローチを採用した：

1. バイオインフォマティクス解析： 著者らは、公開データセット（UCSC Genome Browser、ChIP-seq、ChromHMM）を利用して、複数の脊椎動物種におけるCR1、CR2、およびCR3のエピジェネティックおよび転写シグネチャーを解析した。彼らは、配列アライメントを用いて保存パターンを評価し、SNP密度を分析し、転写因子結合部位およびヒストン修飾プロファイル（例：H3K27me3、H3K4me1/3）をマッピングした。
2. CRISPR-Cas9 ゲノム編集： in vivoでの機能を調査するため、研究者らはCR2およびCR3を個別に、あるいは組み合わせて、また遺伝子間領域を含めて標的とする複数のgRNAを設計した。彼らはモザイク状の始祖胚を生成し、生殖細胞系列を介して伝達可能な欠失を特定するために数千個体をスクリーニングした。
3. 表現型および分子特性解析： 確立された変異体系統（CR2∆626）に対し、著者らは以下を実施した：
   • 形態学的スクリーニング： 体軸形成、体節分節（xirp2a染色による）、頭蓋顔面の発達（アリザリンレッド/アルシアンブルー染色）、および胸鰭の発達の評価。
   • 遺伝学的スクリーニング： メンデルの法則に従う比率および繁殖生存率の分析。
   • 発現プロファイリング： Hoxd遺伝子の空間的・時間的な発現（hoxd3, hoxd4, hoxd9-13, evx2）を、受精後16、24、48時間（hpf）においてRNA in situハイブリダイゼーション（RNA-ISH）を用いて解析した。
   • 定量的解析： RNA-ISHでは見逃される可能性のあるHoxd複合体遺伝子の微細な定量的発現変化を検出するために、RT-qPCRを行った。
   • 転写状態： ストランド特異的なRNA-ISHを用いて、CR2およびCR3が非コードRNAとして転写されているかどうかを決定した。

主な結果

• 生殖細胞系列の伝達と生存能： サイズおよび保存性に依存した明確な関係が観察された。コアとなるCR2、CR3、またはCR2/3の両方のローカスを完全に欠失させた場合、広範なスクリーニングにもかかわらず、生殖細胞系列を通じて伝達することができなかった。対照的に、CR2内のより小さく、保存性の低い626-bpのサブリージョン欠失（CR2∆626と命名）は、安定したホモ接合体生存系統をもたらした。
• 表現型解析： CR2∆626ホモ接合体ゼブラフィッシュ系統は、顕著な発生学的欠陥を示さなかった。以下の項目において有意な差は見られなかった：
  • 一次および二次的な体軸形成。
  • 体節の数および形態。
  • 頭蓋顔面の骨格および軟骨の発達。
  • 胸鰭の形態形成。
  • 繁殖率、産卵数、または生存率（メンデルの比率は維持された）。
• 遺伝子発現：
  • 空間的解析： RNA-ISHは、24および48 hpfにおけるHoxd遺伝子（前方から後方へ）およびevx2の空間的発現ドメインが、野生型（WT）と比較して変化していないことを示した（胸鰭芽を含む）。
  • 定量的解析： RNA-ISHでは有意な変化は見られなかったが、RT-qPCRは、変異体系統において24および48 hpfにおけるすべてのHoxd複合体遺伝子の発現に、一貫した緩やかな上昇傾向があることを明らかにした。ただし、これらの変化は統計的に有意ではなかった。
• バイオインフォマティクスの知見：
  • 保存性： コアとなるCR2およびCR3の配列は、脊椎動物間でほぼ完璧に保存されているが、欠失した626-bpのサブリージョンは斑状の保存性を示した（哺乳類では強いが、Xenopusやゼブラフィッシュでは欠如している）。
  • エピジェネティクス： 欠失したサブリージョンは、細胞種を問わずポリコーム群タンパク質（H3K27me3）によって一様に抑制されている。対照的に、保持されたコアCR2は、特定の細胞株において「二価的」または「ポイズド（準備状態）」なプロモーターシグネチャーを示し、胚の肢において活性エンハンサーマーカーを示す。
  • 転写： ストランド特異的なRNA-ISHにより、CR2およびCR3がHoxd遺伝子と同じ方向（evx2とは逆方向）に転写されていることが検出された。信号は64細胞期から観察され（母性依存を示唆）、24 hpfまでに前方領域（眼、脳、前方体節）に限定された。

意義および主張
本論文は、CR2およびCR3内のコアとなる超保存配列は発生学的に不可欠であると主張している。なぜなら、それらの完全な除去は致死となるか、あるいは生殖細胞系列の伝達を妨げるからである。この知見は、超保存性が表現型として不活性であるという概念に反論するものである。

しかし、本研究は同時に、これら要素の隣接する、より保存性の低いサブリージョン（具体的にはCR2の626-bp領域）が、ゼブラフィッシュにおける粗大な形態形成には不要であることを示している。著者らは、CR2∆626系統において、保存された要素の欠失にもかかわらず顕著な表現型が見られない理由として、以下の可能性を挙げている：

1. 系統特異性： 欠失したサブリージョンは、高等脊椎動物（例：哺乳類の指の形成）においてのみ不可欠な調節的役割を獲得した可能性がある。
2. 機能的冗長性： 無傷のコアCR2およびCR3、ならびに広範な遺伝的バッファリングネットワークが、サブリージョンの喪失を補完している可能性がある。
3. 定量的 vs 質的効果： 欠失したサブリージョンは、通常、Hoxd転写に対して弱い恒常的な抑制入力を提供している可能性がある。その除去は、緩やかな、かつ統計的に有意ではない上昇をもたらすが、それは顕著な形態学的欠陥を引き起こす閾値には達していない。

著者らは、単一の超保存領域内において、機能的な制約はコア部分に集中しており、隣接する配列は特定の文脈においては不要となり得ると結論付けている。また、CR由来の非コードRNAがHoxdの調節に関与している可能性を強調し、転写出を微調整するために転写産物が自身のゲノムローカスに結合するという「セルフ・テザリング（自己係留）」メカニズムの可能性を示唆しているが、これはあくまで推測の域を出ず、未検証である。本研究は、要素の欠失が及ぼす機能的影響は、要素のどの部分が除去されるか、および特定の発生学的文脈に決定的に依存することを浮き彫りにしている。