Capillary associated macrophages regulate vascular permeability through VEGF / PI3K / Akt pathway to affect the effect of lung cancer chemotherapy

Sintesi Tecnica: I macrofagi associati ai capillari regolano la permeabilità vascolare attraverso la via VEGF/PI3K/Akt per influenzare l'efficacia della chemioterapia nel cancro al polmone

Problematica
Il cancro al polmone rimane la principale causa di mortalità per cancro a livello globale, con la chemioterapia che funge da pilastro terapeutico per gli stadi avanzati. Tuttavia, la resistenza alla chemioterapia porta a recidive e metastasi in circa il 50% dei pazienti. Un meccanismo critico alla base di questa resistenza è l'insufficiente consegna degli agenti chemioterapici al nucleo tumorale, guidata da un'anomala permeabilità vascolare all'interno del microambiente tumorale (TME). Sebbene i macrofagi associati al tumore (TAM) siano noti per influenzare il TME, il ruolo specifico dei macrofagi associati ai capillari (CAM)—un sottogruppo di macrofagi localizzati specificamente attorno ai vasi sanguigni (CD169+/F4/80+)—nella regolazione della permeabilità vascolare e della consegna dei farmaci chemioterapici nel cancro al polmone non è stato ancora elucidato.

Metodologia
Lo studio ha impiegato un approccio multifaccettato combinando modelli murini in vivo, sistemi di co-coltura in vitro e tecniche di biologia molecolare:

• Modelli Animali: Sono stati stabiliti modelli di xenotrapianto sottocutaneo utilizzando quattro linee cellulari di cancro al polmone (A549, H1975, H1299 e LLC) in topi C57BL/6. Per colpire specificamente i CAM, sono stati utilizzati topi transgenici CD169-DTR, che permettono la specifica deplezione dei CAM tramite iniezione di tossina difterica (DT).
• Coltura Cellulare: È stato stabilito un sistema di co-coltura microvascolare utilizzando cellule di cancro al polmone umano e cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). I CAM sono stati isolati dai tessuti tumorali mediante selezione con particelle magnetiche CD169.
• Saggi Funzionali:
  • Permeabilità Vascolare: Valutata tramite saggi di perdita di Evans blue in vivo e saggi transwell con FITC-destrano in vitro.
  • Efficacia del Farmaco: I tassi di inibizione tumorale sono stati misurati dopo il trattamento con cisplatino (DDP).
  • Meccanismi Molecolari: Immunoistochimica (IHC), immunofluorescenza (IF), Western blotting, qPCR e RNA-seq sono stati utilizzati per analizzare l'espressione proteica, le vie di segnalazione (VEGFR2/PI3K/Akt) e la dinamica della VE-caderina.
  • Tracciamento dell'Endocitosi: La microscopia confocale in tempo reale è stata utilizzata per visualizzare l'endocitosi di VE-caderina-GFP in tempo reale.
• Strategie di Intervento: Lo studio ha utilizzato inibitori specifici (SU5416, LY294002, MK-2206, dynasore, ecc.) e anticorpi neutralizzanti contro VEGF e TNFα per scomporre le vie di segnalazione.

Contributi Chiave e Risultati

1. Correlazione tra CAM, Permeabilità e Resistenza alla Chemioterapia:
   Lo studio ha stabilito che la densità di infiltrazione dei CAM è positivamente correlata alla permeabilità vascolare tumorale e negativamente correlata alla risposta alla chemioterapia. Nei modelli con alta densità di CAM (H1975, LLC), la permeabilità vascolare era significativamente più alta e l'efficacia del cisplatino era minore rispetto ai modelli con minore densità di CAM (A549).

2. Ruolo Causale dei CAM nella Disfunzione Vascolare:
   La specifica deplezione dei CAM nei topi CD169-DTR ha portato a una riduzione del 55% della permeabilità vascolare e a un significativo potenziamento dell'effetto inibitorio del cisplatino sul tumore. Fondamentalmente, questo miglioramento è avvenuto senza alterare la densità dei microvasi o indurre apoptosi endoteliale, indicando che i CAM regolano la funzione vascolare piuttosto che l'angiogenesi.

3. Meccanismo d'Azione: Endocitosi della VE-Caderina:
   È stato scoperto che i CAM inducono l'internalizzazione della VE-caderina (una proteina critica delle giunzioni serrate) tramite endocitosi clatrina-dipendente.

• L'imaging in tempo reale ha rivelato che il mezzo condizionato dai CAM (CAMs-CM) ha innescato una rapida endocitosi della VE-caderina, con un picco a 30 minuti.
• I livelli proteici totali di VE-caderina sono rimasti invariati, confermando che il meccanismo è una ridistribuzione (endocitosi) piuttosto che una degradazione.
• L'inibizione dell'endocitosi mediata dalla clatrina tramite dynasore ha invertito l'aumento della permeabilità e ripristinato la sensibilità alla chemioterapia.

4. Profilo Secretorio e Via di Segnalazione:
   L'analisi RNA-seq e del microarray delle citochine ha identificato che i CAM secernono alti livelli di VEGF e TNFα.

• La neutralizzazione di VEGF o TNFα ha bloccato l'aumento della permeabilità indotto dai CAM.
• Queste citochine attivano la via di segnalazione VEGFR2/PI3K/Akt nelle cellule endoteliali.
• A valle di Akt, lo studio ha identificato un asse sinergico che coinvolge GSK3β e PKCζ. La fosforilazione di GSK3β (Ser9) e PKCζ (Thr410) indotta dai CAM guida l'endocitosi della VE-caderina mediata dalla clatrina.
• L'inibizione di questo intero asse (VEGFR2, PI3K, Akt, GSK3β o PKCζ) ha invertito significativamente l'iperpermeabilità vascolare.

Significato e Rivendicazioni
Gli autori affermano che questo studio è il primo a identificare i CAM come regolatori chiave dell'asse "permeabilità vascolare–consegna dei farmaci chemioterapici" nel cancro al polmone. Il significato del lavoro risiede in:

• Meccanismo Novello: L'elucidazione di una specifica via molecolare (VEGF/TNFα → VEGFR2/PI3K/Akt → GSK3β/PKCζ → endocitosi della VE-caderina) attraverso la quale un sottogruppo specifico di macrofagi interrompe l'integrità vascolare.
• Strategia Terapeutica: La proposta che colpire i CAM, o bloccare la loro specifica via di segnalazione (specificamente l'endocitosi della VE-caderina), offra una nuova strategia per superare la resistenza alla chemioterapia normalizzando la permeabilità vascolare per migliorare la consegna dei farmaci.
• Differenziazione dai TAM: Evidenziare che, diversamente dai TAM generali, i CAM sono unicamente posizionati per interagire direttamente con le cellule endoteliali per modulare la funzione vascolare senza necessariamente guidare l'angiogenesi.

Lo studio conclude che combinare la chemioterapia con strategie per depletare i CAM o inibire la loro specifica via di segnalazione potrebbe migliorare significativamente l'efficacia del trattamento del cancro al polmone. Gli autori riconoscono i limiti riguardanti la dipendenza da modelli di xenotrapianto murini e la necessità di future validazioni su campioni clinici.