Capillary associated macrophages regulate vascular permeability through VEGF / PI3K / Akt pathway to affect the effect of lung cancer chemotherapy

기술 요약: 모세혈관 관련 대식세포가 VEGF/PI3K/Akt 경로를 통해 혈관 투과성을 조절하여 폐암 화학요법 효능에 미치는 영향

문제 제기
폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인으로 남아 있으며, 화학요법은 진행된 단계의 치료를 위한 초석 역할을 합니다. 그러나 화학요법 저항성은 약 100%의 환자에서 재발 및 전이를 초래합니다. 이러한 저항성의 핵심 기전 중 하나는 종양 미세환경(TME) 내의 비정상적인 혈관 투과성으로 인해 종양 핵(core)으로의 화학요법 약물 전달이 불충분하다는 점입니다. 종양 관련 대식세포(TAMs)가 종양 미세환경에 영향을 미친다는 사실은 알려져 있으나, 혈관 주변에 특이적으로 위치한 대식세포 아집단인 모세혈관 관련 대식세포(CAMs)(CD169+/F4/80+ 세포)가 폐암의 혈관 투과성 및 화학요법 약물 전달을 조절하는 구체적인 역할은 밝혀지지 않았습니다.

연구 방법론
본 연구는 in vivo 마우스 모델, in vitro 공동 배양 시스템, 그리고 분자 생물학적 기법을 결합한 다각적인 접근 방식을 채택했습니다:

• 동물 모델: 네 가지 폐암 세포주(A549, H1975, H1299, LLC)를 C57BL/6 마우스에 이식한 피하 이종 이식 모델을 구축했습니다. CAMs를 특이적으로 표적하기 위해, 디프테리아 독소(DT) 주입을 통해 CAMs를 특이적으로 제거할 수 있는 CD169-DTR 형질 전환 마우스를 활용했습니다.
• 세포 배양: 인간 폐암 세포와 인간 제대 정맥 내피세포(HUVECs)를 이용한 미세혈관 공동 배양 시스템을 구축했습니다. CAMs는 CD169 자기 비드 분리법을 사용하여 종양 조직에서 분리했습니다.
• 기능 분석:
  • 혈관 투과성: in vivo에서는 Evans blue 누출 분석을, in vitro에서는 FITC-dextran transwell 분석을 통해 평가했습니다.
  • 약물 효능: 시스플라틴(DDP) 처리 후 종양 억제율을 측정했습니다.
  • 분자 기전: 면역조직화학(IHC), 면역형광(IF), 웨스턴 블롯팅, qPCR, RNA-seq을 사용하여 단백질 발현, 신호 전달 경로(VEGFR2/PI3K/Akt), 그리고 VE-cadherin 역동성을 분석했습니다.
  • 내포 작용 추적: 실시간 live-cell 공초점 현미경을 사용하여 VE-cadherin-GFP의 내포 작용(endocytosis)을 실시간으로 시각화했습니다.
• 중재 전략: 신호 전달 경로를 규명하기 위해 특정 억제제(SU5416, LY294002, MK-2206, dynasore 등)와 VEGF 및 TNFα에 대한 중화 항체를 사용했습니다.

주요 기여 및 결과

1. CAMs, 투과성 및 화학요법 저항성 간의 상관관계:
   본 연구는 CAMs 침윤 밀도가 종양 혈관 투과성과 양의 상관관계를 가지며, 화학요법 반응성과는 음의 상관관계를 가진다는 것을 입증했습니다. CAMs 밀도가 높은 모델(H1975, LLC)에서는 CAMs 밀도가 낮은 모델(A549)에 비해 혈관 투과성이 유의하게 높았고, 시스플라틴의 효능은 낮았습니다.

2. 혈관 기능 장애에 대한 CAMs의 인과적 역할:
   CD169-DTR 마우스에서 CAMs를 특이적으로 제거했을 때, 혈관 투과성이 55% 감소하였으며 시스플라틴의 종양 억제 효과가 유의하게 향상되었습니다. 결정적으로, 이러한 개선은 미세혈관 밀도를 변화시키거나 내피세포 사멸을 유도하지 않은 상태에서 발생하였는데, 이는 CAMs가 혈관 생성(angiogenesis)이 아닌 혈관 기능을 조절함을 나타냅니다.

3. 작용 기전: VE-Cadherin 내포 작용:
   CAMs가 **클라트린 의존적 내포 작용(clathrin-dependent endocytosis)**을 통해 (핵심적인 밀착 결합 단백질인) VE-cadherin의 내부화를 유도한다는 것을 발견했습니다.

• Live-cell 이미징 결과, CAMs 조건 배지(CAMs-CM)가 VE-cadherin의 급격한 내포 작용을 유발하며, 이는 30분에서 정점에 도달했습니다.
• 총 VE-cadherin 단백질 수준은 변하지 않았으며, 이는 기전이 분해가 아닌 재분배(내포 작용)임을 확인시켜 줍니다.
• Dynasore를 사용하여 클라트린 매개 내포 작용을 억제했을 때, 투과성 증가가 역전되고 화학요법 민감도가 회복되었습니다.

4. 분비 프로파일 및 신호 전달 경로:
   RNA-seq 및 사이토카인 어레이 분석을 통해 CAMs가 고농도의 VEGF 및 TNFα를 분비함을 확인했습니다.

• VEGF 또는 TNFα를 중화하면 CAMs에 의해 유도된 투과성 증가가 차단되었습니다.
• 이 사이토카인들은 내피세포에서 VEGFR2/PI3K/Akt 신호 전달 경로를 활성화합니다.
• Akt 하위 단계에서, 본 연구는 GSK3β 및 PKCζ를 포함하는 시너지 축을 확인했습니다. CAMs에 의한 GSK3β(Ser9) 및 PKCζ(Thr410)의 인산화가 클라트린 의존적 VE-cadherin 내포 작용을 유도합니다.
• 이 전체 축(VEGFR2, PI3K, Akt, GSK3β 또는 PKCζ)을 억제하면 혈관 과투과성이 유의하게 역전되었습니다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 폐암에서 "혈관 투과성-화학요법 약물 전달" 축을 조절하는 핵심 조절자로서 CAMs를 식별한 최초의 연구라고 주장합니다. 본 연구의 의의는 다음과 같습니다:

• 새로운 기전: 특정 대식세포 아집단이 어떻게 혈관 무결성을 파괴하는지에 대한 구체적인 분자 경로(VEGF/TNFα → VEGFR2/PI3K/Akt → GSK3β/PKCζ → VE-cadherin 내포 작용)를 규명했습니다.
• 치료 전략: CAMs를 제거하거나 그 하위 신호 전달(특히 VE-cadherin 내포 작용)을 차단하는 것이 혈관 투과성을 정상화하여 약물 전달을 개선함으로써 화학요법 저항성을 극복하는 새로운 전략이 될 수 있음을 제안합니다.
• TAMs와의 차별점: 일반적인 TAMs와 달리, CAMs는 혈관 생성을 반드시 유도하지 않으면서도 내피세포와 직접 상호작용하여 혈관 기능을 조절하는 데 독특한 위치에 있음을 강조했습니다.

본 연구는 CAMs를 제거하거나 이들의 특이적 신호 전달 경로를 억제하는 전략을 화학요법과 병용하는 것이 폐암 치료의 효능을 크게 높일 수 있다고 결론지었습니다. 저자들은 마우스 이종 이식 모델에 의존한 점과 향후 임상 샘플 검증의 필요성에 대한 한계를 인정했습니다.