Capillary associated macrophages regulate vascular permeability through VEGF / PI3K / Akt pathway to affect the effect of lung cancer chemotherapy

Resumo Técnico: Macrófagos Associados a Capilares Regulam a Permeabilidade Vascular via a Via VEGF/PI3K/Akt para Afetar a Eficácia da Quimioterapia no Câncer de Pulmão

Definição do Problema
O câncer de pulmão continua sendo a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer globalmente, com a quimioterapia servindo como um pilar fundamental para estágios avançados. No entanto, a resistência à quimioterapia leva à recorrência e metástase em aproximadamente 50% dos pacientes. Um mecanismo crítico subjacente a essa resistência é a entrega insuficiente de agentes quimioterápicos ao núcleo do tumor, impulsionada por uma permeabilidade vascular anormal dentro do microambiente tumoral (TME). Embora os macrófagos associados ao tumor (TAMs) sejam conhecidos por influenciar o TME, o papel específico dos macrófagos associados a capilares (CAMs) — um subconjunto de macrófagos especificamente localizados ao redor de vasos sanguíneos (CD169+/F4/80+) — na regulação da permeabilidade vascular e na entrega de fármacos quimioterápicos no câncer de pulmão ainda não foi elucidado.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem multifacetada combinando modelos de camundongos in vivo, sistemas de cocultura in vitro e técnicas de biologia molecular:

• Modelos Animais: Modelos de xenotransplante subcutâneo foram estabelecidos utilizando quatro linhagens de células de câncer de pulmão (A549, H1975, H1299 e LLC) em camundongos C57BL/6. Para visar especificamente os CAMs, camundongos transgênicos CD169-DTR foram utilizados, permitindo a depleção específica de CAMs via injeção de toxina diftérica (DT).
• Cultura Celular: Um sistema de cocultura microvascular foi estabelecido utilizando células de câncer de pulmão humano e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Os CAMs foram isolados de tecidos tumorais usando separação por esferas magnéticas CD169.
• Ensaios Funcionais:
  • Permeabilidade Vascular: Avaliada via ensaios de vazamento de Evans blue in vivo e ensaios de transwell com FITC-dextran in vitro.
  • Eficácia de Fármacos: As taxas de inibição tumoral foram medidas após o tratamento com cisplatina (DDP).
  • Mecanismos Moleculares: Imuno-histoquímica (IHC), imunofluorescência (IF), Western blotting, qPCR e RNA-seq foram usados para analisar a expressão proteica, vias de sinalização (VEGFR2/PI3K/Akt) e a dinâmica da VE-caderina.
  • Rastreamento de Endocitose: Microscopia confocal de célula viva foi usada para visualizar a endocitose de VE-caderina-GFP em tempo real.
• Estratégias de Intervenção: O estudo utilizou inibidores específicos (SU5416, LY294002, MK-2206, dynasore, etc.) e anticorpos neutralizantes contra VEGF e TNFα para dissecar as vias de sinalização.

Principais Contribuições e Resultados

1. Correlação entre CAMs, Permeabilidade e Resistência à Quimioterapia:
   O estudo estabeleceu que a densidade de infiltração de CAMs é positivamente correlacionada com a permeabilidade vascular tumoral e negativamente correlacionada com a resposta à quimioterapia. Em modelos com alta densidade de CAMs (H1975, LLC), a permeabilidade vascular foi significativamente maior, e a eficácia da cisplatina foi menor em comparação com modelos com menor densidade de CAMs (A549).

2. Papel Causal dos CAMs na Disfunção Vascular:
   A depleção específica de CAMs em camundongos CD169-DTR resultou em uma redução de 55% na permeabilidade vascular e um aumento significativo no efeito inibidor tumoral da cisplatina. Crucialmente, essa melhoria ocorreu sem alterar a densidade microvascular ou induzir apoptose endotelial, indicando que os CAMs regulam a função vascular em vez da angiogênese.

3. Mecanismo de Ação: Endocitose de VE-Caderina:
   Descobriu-se que os CAMs induzem a internalização da VE-caderina (uma proteína crítica de junção estreita) via endocitose dependente de clatrina.

• A imagem de célula viva revelou que o meio condicionado de CAMs (CAMs-CM) desencadeou a endocitose rápida de VE-caderina, atingindo o pico em 30 minutos.
• Os níveis totais de proteína VE-caderina permaneceram inalterados, confirmando que o mecanismo é redistribuição (endocitose) e não degradação.
• A inibição da endocitose mediada por clatrina usando dynasore reverteu o aumento da permeabilidade e restaurou a sensibilidade à quimioterapia.

4. Perfil Secretório e Via de Sinalização:
   A análise de RNA-seq e o array de citocinas identificaram que os CAMs secretam altos níveis de VEGF e TNFα.

• A neutralização de VEGF ou TNFα bloqueou o aumento da permeabilidade induzido pelos CAMs.
• Essas citocinas ativam a via de sinalização VEGFR2/PI3K/Akt nas células endoteliais.
• A jusante de Akt, o estudo identificou um eixo sinérgico envolvendo GSK3β e PKCζ. A fosforilação de GSK3β (Ser9) e PKCζ (Thr410) induzida pelos CAMs impulsiona a endocitose dependente de clatrina da VE-caderina.
• A inibição de todo este eixo (VEGFR2, PI3K, Akt, GSK3β ou PKCζ) reverteu significativamente a hiperpermeabilidade vascular.

Significância e Alegações
Os autores afirmam que este estudo é o primeiro a identificar os CAMs como um regulador chave do eixo "permeabilidade vascular–entrega de fármaco quimioterápico" no câncer de pulmão. A significância do trabalho reside em:

• Mecanismo Inédito: Elucidar uma via molecular específica (VEGF/TNFα → VEGFR2/PI3K/Akt → GSK3β/PKCζ → endocitose de VE-caderina) pela qual um subconjunto específico de macrófagos interrompe a integridade vascular.
• Estratégia Terapêutica: Propor que o alvo dos CAMs, ou o bloqueio de sua sinalização a jusante (especificamente a endocitose de VE-caderina), oferece uma nova estratégia para superar a resistência à quimioterapia ao normalizar a permeabilidade vascular para melhorar a entrega de fármacos.
• Diferenciação de TAMs: Destacar que, ao contrário dos TAMs gerais, os CAMs estão posicionados de forma única para interagir diretamente com as células endoteliais para modular a função vascular sem necessariamente impulsionar a angiogênese.

O estudo conclui que combinar a quimioterapia com estratégias para depletar os CAMs ou inibir sua via de sinalização específica poderia aumentar significativamente a eficácia do tratamento do câncer de pulmão. Os autores reconhecem as limitações quanto à dependência de modelos de xenotransplante em camundongos e a necessidade de validação futura em amostras clínicas.