Capillary associated macrophages regulate vascular permeability through VEGF / PI3K / Akt pathway to affect the effect of lung cancer chemotherapy

Resumen Técnico: Los macrófagos asociados a capilares regulan la permeabilidad vascular a través de la vía VEGF/PI3K/Akt para afectar la eficacia de la quimioterapia en el cáncer de pulmón

Planteamiento del problema
El cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial, siendo la quimioterapia un pilar fundamental para los estadios avanzados. Sin embargo, la resistencia a la quimioterapia provoca recurrencia y metástasis en aproximadamente el 50% de los pacientes. Un mecanismo crítico subyacente a esta resistencia es la entrega insuficiente de agentes quimioterapéuticos al núcleo del tumor, impulsada por una permeabilidad vascular anormal dentro del microambiente tumoral (TME). Aunque se sabe que los macrófagos asociados a tumores (TAMs) influyen en el TME, el papel específico de los macrófagos asociados a capilares (CAMs) —un subconjunto de macrófagos localizados específicamente alrededor de los vasos sanguíneos (CD169+/F4/80+)— en la regulación de la permeabilidad vascular y la entrega de fármacos quimioterapéuticos en el cáncer de pulmón no ha sido elucidado.

Metodología
El estudio empleó un enfoque multifacético que combinó modelos de ratón in vivo, sistemas de cocultivo in vitro y técnicas de biología molecular:

• Modelos animales: Se establecieron modelos de xenoinjerto subcutáneo utilizando cuatro líneas celulares de cáncer de pulmón (A549, H1975, H1299 y LLC) en ratones C57BL/6. Para dirigir específicamente a los CAMs, se utilizaron ratones transgénicos CD169-DTR, lo que permitió la depleción específica de los CAMs mediante la inyección de toxina diftérica (DT).
• Cultivo celular: Se estableció un sistema de cocultivo microvascular utilizando células de cáncer de pulmón humano y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs). Los CAMs fueron aislados de tejidos tumorales mediante la clasificación por perlas magnéticas CD169.
• Ensayos funcionales:
  • Permeabilidad vascular: Evaluada mediante ensayos de fuga de azul de Evans in vivo y ensayos de transwell con FITC-dextrano in vitro.
  • Eficacia de fármacos: Las tasas de inhibición tumoral se midieron tras el tratamiento con cisplatino (DDP).
  • Mecanismos moleculares: La inmunohistoquímica (IHC), la inmunofluorescencia (IF), el Western blot, la qPCR y la secuenciación de ARN (RNA-seq) se utilizaron para analizar la expresión de proteínas, las vías de señalización (VEGFR2/PI3K/Akt) y la dinámica de la VE-cadherina.
  • Seguimiento de la endocitosis: La microscopía confocal de célula viva se utilizó para visualizar en tiempo real la endocitosis de VE-cadherina-GFP.
• Estrategias de intervención: El estudio utilizó inhibidores específicos (SU5416, LY294002, MK-2206, dynasore, etc.) y anticuerpos neutralizantes contra VEGF y TNFα para diseccionar las vías de señalización.

Contribuciones clave y resultados

1. Correlación entre CAMs, permeabilidad y resistencia a la quimioterapia:
   El estudio estableció que la densidad de infiltración de los CAMs está positivamente correlacionada con la permeabilidad vascular de los tumores y negativamente correlacionada con la respuesta a la quimioterapia. En modelos con alta densidad de CAMs (H1975, LLC), la permeabilidad vascular fue significativamente mayor y la eficacia del cisplatino fue menor en comparación con modelos con menor densidad de CAMs (A549).

2. Papel causal de los CAMs en la disfunción vascular:
   La depleción específica de los CAMs en ratones CD169-DTR resultó en una reducción del 55% en la permeabilidad vascular y un aumento significativo del efecto inhibidor tumoral del cisplatino. Crucialmente, esta mejora ocurrió sin alterar la densidad microvascular ni inducir la apoptosis endotelial, lo que indica que los CAMs regulan la función vascular más que la angiogénesis.

3. Mecanismo de acción: Endocitosis de la VE-cadherina:
   Se descubrió que los CAMs inducen la internalización de la VE-cadherina (una proteína crítica de la unión estrecha) a través de la endocitosis dependiente de clatrina.

• La imagen de célula viva reveló que el medio condicionado de los CAMs (CAMs-CM) desencadenó una rápida endocitosis de la VE-cadherina, alcanzando su pico a los 30 minutos.
• Los niveles totales de la proteína VE-cadherina permanecieron inalterados, confirmando que el mecanismo es de redistribución (endocitosis) y no de degradación.
• La inhibición de la endocitosis mediada por clatrina mediante el uso de dynasore revirtió el aumento de la permeabilidad y restauró la sensibilidad a la quimioterapia.

4. Perfil secretor y vía de señalización:
   El análisis de RNA-seq y el array de citocinas identificaron que los CAMs secretan altos niveles de VEGF y TNFα.

• La neutralización de VEGF o TNFα bloqueó el aumento de la permeabilidad inducido por los CAMs.
• Estas citocinas activan la vía de señalización VEGFR2/PI3K/Akt en las células endoteliales.
• Corriente abajo de Akt, el estudio identificó un eje sinérgico que involucra a GSK3β y PKCζ. La fosforilación de GSK3β (Ser9) y PKCζ (Thr410) inducida por los CAMs impulsa la endocitosis de la VE-cadherina dependiente de clatrina.
• La inhibición de todo este eje (VEGFR2, PI3K, Akt, GSK3β o PKCζ) revirtió significativamente la hiperpermeabilidad vascular.

Significancia y alegatos
Los autores afirman que este estudio es el primero en identificar a los CAMs como un regulador clave del eje "permeabilidad vascular–entrega de fármacos quimioterapéuticos" en el cáncer de pulmón. La significancia del trabajo radica en:

• Mecanismo novedoso: Elucidar una vía molecular específica (VEGF/TNFα → VEGFR2/PI3K/Akt → GSK3β/PKCζ → endocitosis de VE-cadherina) mediante la cual un subconjunto específico de macrófagos altera la integridad vascular.
• Estrategia terapéutica: Proponer que el objetivo de los CAMs, o el bloqueo de su señalización descendente (específicamente la endocitosis de la VE-cadherina), ofrece una nueva estrategia para superar la resistencia a la quimioterapia al normalizar la permeabilidad vascular para mejorar la entrega de fármacos.
• Diferenciación de los TAMs: Destacar que, a diferencia de los TAMs generales, los CAMs están posicionados de manera única para interactuar directamente con las células endoteliales para modular la función vascular sin necesariamente impulsar la angiogénesis.

El estudio concluye que combinar la quimioterapia con estrategias para depletar los CAMs o inhibir su vía de señalización específica podría mejorar significativamente la eficacia del tratamiento del cáncer de pulmón. Los autores reconocen las limitaciones respecto a la dependencia de modelos de xenoinjerto en ratones y la necesidad de validación futura con muestras clínicas.