A robust, scalable K-statistic for quantifying immune cell clustering in spatial proteomics data

技術要約：空間プロテオミクスデータにおける免疫細胞のクラスタリングを定量化するための、堅牢でスケーラブルなK統計量

問題提起
空間プロテオミクス技術は、組織サンプル内におけるタンパク質の存在量と細胞の位置を測定することを可能にし、空間的コンテキストを保持する。これらのデータを分析する一般的なアプローチは、細胞が空間的にクラスター化しているか、あるいはランダムに分散しているかを定量化するための指標であるリプリーの$K$関数である。リプリーの$K$の標準的な適用は、サンプルの任意の部分集合における期待細胞数がサンプル全体で一貫しているという完全空間ランダム性（CSR）の仮定に依存しており、その理論的な帰無値は$K_0(r) = \pi r^2$となる。

しかし、空間プロテオミクスデータは、生物学的要因（例：組織構造）や技術的アーティファクト（例：組織の劣化、裂け目、またはイメージング中のスライドへの不完全な接着）により、この均質性の仮定に違反することが頻繁にある。不均質なデータに対して標準的な理論的帰無値が適用されると、空間的なクラスター化および共局在が過大評価される。このバイアスは、技術的なアーティファクトと生物学的なシグナルを混同させることで、細胞間の相互作用と患者の生存率を結びつけるようなダウンストリームの解析を歪める可能性がある。背景細胞の情報を無視することでバイアスを導入する可能性のある不均質性の対応策（不均質なリプリーの$K$など）や、モンテカルロ法によって近似する際に計算量が多くなり、サンプリング誤差を導入する手法（置換ベースの経験的帰無値など）といった既存の手法には限界がある。

手法：KAMP
著者らは、不均質性に対して堅牢に空間構成を定量化しつつ、計算のスケーラビリティを維持するように設計された新しい手法であるKAMP（K adjustment by Analytical Moments of the Permutation distribution：置換分布の解析的モーメントによるK調整）を提案している。

1. 帰無仮説と置換フレームワーク：
   KAMPは「比例強度」の帰無仮説（$H_0$）を採用しており、これは免疫細胞の空間強度が背景細胞の空間強度に比例するというもの（$\lambda_m(u) \propto \lambda_{n-m}(u)$）である。この仮説の下では、免疫細胞は全細胞集団のランダムなサブセットとして分布する。本手法は、細胞の配置を固定したまま、細胞ラベル（免疫細胞 vs 背景細胞）の考えうるすべての置換を考慮することで、経験的な帰無値ベンチマークを構築する。

2. 解析的モーメント：
   計算負荷の高い置換を行う代わりに、KAMPは置換分布におけるリプリーの$K$の第1および第2モーメント（平均と分散）の閉形式の解析的表現を導出する。

   • 期待値： 置換帰無仮説下での期待値$E(K_s(r))$は、サンプル内のすべての細胞（免疫細胞と背景細胞を統合したもの）を用いて計算された単変量リプリーの$K$と等価であることが示されている。これにより、既存のソフトウェアを使用して経験的帰無値を直接計算することが可能になる。
   • 分散： 著者らは、置換分布内におけるペアおよび高次の相互作用を考慮した、複雑な組合せ論的公式である$Var(K_s(r))$を導出している。
   • 漸近正規性： 定理2.4は、近傍の寄与に関する特定の正則条件が満たされる場合、細胞数が増加するにつれて、テスト統計量$Z_{K_s(r)} = (\hat{K}_s(r) - E(K_s(r))) / \sqrt{Var(K_s(r))}$が標準正規分布に収束することを確立している。

3. 計算効率（KAMP Lite）：
   極めて大規模なデータセット（例：100万個を超える細胞）を扱うために、著者らは計算前に点のランダムな間引き（thinning）を行うKAMP Liteを導入している。点過程の理論的特性により、間引きは分布の特性を保持することが保証されており、計算時間を大幅に削減しながらモーメントの正確な近似が可能となる。

4. 推論：
   本手法は以下を提供する。

   • 補正されたクラスタリング指標：$\tilde{K}_s(r) = \hat{K}_s(r) - E(K_s(r))$。
   • 正の過剰なクラスター化または共局在に関する、サンプル内での仮説検定のための近似p値。
   • $\tilde{K}_s(r)$を共変量として生存モデル（例：Cox比例ハザードモデル）で使用するための、サンプル間解析のフレームワーク。

主な結果
論文では、シミュレーションおよび高異型漿液性卵胞癌（HGSOC）データセット（128名の患者、計150万個以上の細胞）への適用を通じてKAMPを評価している。

• シミュレーション研究：

  • バイアス補正： 不均質な帰無シナリオ（組織の裂けをシミュレート）において、標準的なリプリーの$K$および不均質対応型（$K_{hom}$）は、クラスター化を著しく過大評価した。KAMP、KAMP Lite、および完全な置換法は、推定値を正しくゼロを中心としたものに補正した。
  • 検出力と第I種の誤り： KAMPは適切な第I種の誤り率を維持し、様々な細胞密度および存在量において、完全な置換法と同等の高い検出力を示した。
  • 速度： KAMPは置換法よりも数桁高速であった。HGSOCデータセットにおいて、10,000回の置換に562分かかったのに対し、KAMPは3.6分で完了した。KAMP Liteはさらに高速で0.6分であった。

• HGSOCへの適用：

  • サンプル内： KAMPは、真の生物学的クラスター化と技術的な不均質性を効果的に区別した。組織の裂けがあるサンプルでは、経験的帰無値$E(K_s(r))$は理論的な$\pi r^2$よりも有意に高く、KAMPは観測された$K$値を真のクラスター化を反映するように正常に調整した。
  • サンプル間（生存解析）： 研究はB細胞とマクロファージの共局在に焦点を当てた。KAMP由来の共局在指標を用いたモデルは、標準的なリプリーの$K$を用いたモデルと比較して、より強い保護的な生存との関連性と、より高い一致指数（c-index）を示した。標準的な$K$は有意な関連を検出できず、これは不均質性の補正漏れがハザード比の推定をバイアスさせることを示唆している。

意義と主張
本論文は、KAMPが、単変量および二変量のリプリーの$K$に対する第1および第2の置換帰無モーメントの最初の閉形式の特性付けであり、かつ漸近正規近似を伴うものであると主張している。

• 堅牢性： 背景細胞と解析的モーメントを活用することで、KAMPは置換の計算負荷を負うことなく、また背景構造を無視することによるバイアスを招くこともなく、空間的不均質性を補正する。
• スケーラビリティ： 解析的手法はモンテカルロ置換の必要性を排除しており、厳密な置換検定が以前は計算量的に不可能であった大規模な空間プロテオミクスデータ（数百万個の細胞）の解析を可能にする。
• 科学的影響： 卵巣癌への適用は、サンプル内の不均質性を補正しないことが、生存解析をバイアスさせる可能性があることを示している。KAMPは、特定の細胞間相互作用（例：B細胞とマクロファージの共局在）を臨床アウトカムに結びつけるための、統計的に妥当なフレームワークを提供し、標準的な手法では見逃される関連性を明らかにしている。

著者らは、KAMPは過剰なクラスター化を測定するものであることに注意を促している。したがって、もし関心の対象となる生物学的シグナルが背景細胞と共有されている場合（組織構造に沿っている場合）、KAMPはその共有された構造を除去してしまう可能性があり、その特定のシグナルを検出する力を低下させる可能性がある。しかし、背景とは異なる細胞種特異的な相互作用を検出する場合、本手法は堅牢かつスケーラブルなソリューションを提供する。