Lysosomal signaling pathways influence heart rhythm, and regulate atrial function

技術要約：リソソーム・シグナル伝達経路が心拍リズムに影響を及ぼし、心房機能を調節する

問題提起
心室および心房筋細胞における、第二メッセンジャーであるニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（NAADP）と二孔チャネル（TPC）を介したリソソームカルシウム（Ca²⁺）シグナリングが、筋小胞体（SR）へのCa²⁺回収および一過性振幅を増強させる役割については確立されているが、洞結節（SAN）におけるペースメーカー活動への具体的な寄与や、心房疾患におけるリソソーム・シグナリング・マイクロドメインの空間的組織化については未解明である。さらに、リソソームからのCa²⁺放出と、心筋細胞における細胞内3′–5′-環状アデノシン一リン酸（cAMP）プールの調節との潜在的な関連性についても調査されていない。心房細動（AF）には、Ca²⁺ハンドリングやβアドレナリン反応の変化を含む重大な構造的リモデリングが伴うが、この病態におけるSRおよびミトコンドリアに対するリソソームの配置の役割は不明である。

方法論
本研究では、薬理学的阻害、遺伝子欠損、および高度なイメージングを組み合わせた、多種・多角的アプローチを用いた：

• 薬理学的および遺伝学的モデル： 整合したマウス右心房標本（SANを含む）および単離したギニアピッグSAN筋細胞を用い、拍動率とCa²⁺一過性を評価した。阻害剤には、バフィロマイシンA1（V-ATPase阻害剤）、trans-Ned-19（NAADPアンタゴニスト）、およびTPC2特異的モジュレーター（TPC2-A1-Nアゴニスト、SG-094ブロッカー）が含まれる。遺伝子欠損にはTPC2-/-マウスを用いた。
• ヒトおよび幹細胞モデル： ヒトに関連する文脈での知見を検証するため、新生ラット心房筋細胞（NRAM）、ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞（hiPSC-CMs）、および心房心筋細胞（hiPSC-aCMs）を利用した。
• 機能的アッセイ：
  • 変時性／変力性： イソプレナリンに対する用量反応曲線を作成し、拍動率および収縮力を測定した。
  • Ca²⁺イメージング： Fluo-5F-AMを用いて、SAN筋細胞およびhiPSC-CMsにおける自発的なCa²⁺一過性をモニタリングした。
  • cAMPセンシング： EPAC-SH187バイオセンサーを用いたFörster共鳴エネルギー移動（FRET）により、βアドレナリン刺激および直接的なTPC2活性化に対する細胞内cAMPレベルを測定した。
• 構造解析：
  • 電子顕微鏡（EM）： 山羊心房組織（シャム群 vs 6ヶ月AFモデル）およびヒト心房切除片（洞リズム vs 持続性AF）に対して3D電子トモグラフィーを実施し、リソソームのサイズ、密度、およびSRおよびミトコンドリアへの距離を定量化した。
  • 超解像顕微鏡： 4Pi-SMSおよび構造照明顕微鏡（SIM）を用いて、リソソームの分布およびアデニル酸シクラーゼ1（AC1）およびLAMP2との共局在をマッピングした。
• プロテオミクス： ヒト右心房切除片におけるAFでの差異発現タンパク質を特定するために、データ非依存的取得パラレルアキュムレーション・シリーズフラグメンテーション（DIA-PASEF）質量分析を実施した。

主要な貢献と結果

1. SANペースメーカー形成のリソソームによる調節： NAADP経路の薬理学的阻害（バフィロマイシンA1またはtrans-Ned-19による）およびTPC2の遺伝子的欠損は、整合したマウスSAN組織および単離されたギニアピッグSAN筋細胞におけるβアドレナリン刺激（イソプレナリン）に対する変時反応を著しく損なった。これは、自発的な基礎拍動率を変化させることなく、EC50値の右方シフトおよび／または最大拍動率の減少として現れた。
2. リソソームCa²⁺がcAMP生成を駆動する： 本研究は、リソソームからのCa²⁺放出がcAMPシグナリングの新規なトリガーであることを示している。リソソームの酸性化の阻害（バフィロマイシンA1）またはNAADP/TPC2シグナリングの遮断は、NRAMおよびhiPSC-aCMsにおけるイソプレナリン誘発性cAMP蓄積を有意に減少させた。この効果は、細胞外Ca²⁺ゼロの状態およびSRの枯渇後（リアノジン／タプシガルギン投与後）においても持続したことから、直接的またはSRに依存しないメカニズムを示唆している。
3. メカニズム経路（CaMKIIおよびAC1）： TPC2をTPC2-A1-Nで直接活性化すると、cAMPレベルが上昇した。この反応は、CaMKII阻害剤KN-93およびAC1選択的阻害剤ST034307によって減弱した。免疫局在解析により、AC1とLAMP2がSAN筋細胞の細胞膜下領域で共局在していることが確認され、リソソームからのCa²⁺放出がCaMKIIおよび／またはAC1を活性化してcAMPを増強するというモデルを支持した。
4. 心房細動における構造的リモデリング：
   • 山羊モデル： AF組織では、リソソームは洞リズム対照群と比較して有意に大きく、SRから遠くに位置していた。逆に、リソソームはミトコンドリアに有意に近く、膜接触部位（MCSs）の頻度が高かった（約23%から約44%へ増加）。
   • ヒト組織： 持続性AF患者においても同様のリモデリングが見られた。リソソーム径の増大およびSRからの距離の増大が認められた。リソソムがミトコンドリアに近接する傾向は認められたものの、統計的な有意差には至らなかった（p=0.1016）。
5. プロテオミクス変化： ヒトAF組織のプロテオミクスにより、主要なCa²⁺ハンドリングタンパク質（RyR2、Triadin、Calsequestrin 2）のダウンレギュレーション、およびインテグリンシグナリング、マイクロオートファジー、および代謝シフトに関連する経路のアップレギュレーションが明らかになった。

意義
本論文は、リソソームCa²⁺シグナリングが、SANペースメーカーおよび心房筋の両方において、βアドレナリン反応の極めて重要な、これまで認識されていなかった構成要素であることを確立した。本研究は、NAADPを介したリソソームCa²⁺放出が、おそらくCaMKIIおよびAC1を介して細胞内cAMPレベルを調節し、それによって心拍数や収縮力に影響を与えるという、新しいシグナリング軸を提唱している。さらに、本研究は、心房細動が、特にリソソーム、SR、およびミトコンドリアの間の空間的関係を変化させる、保存されたリソソーム・ナノドメインの再編成を伴うことを証拠立てている。これらの構造的変化は、AFで見られるCa²⁺ハンドリングおよびシグナリング・マイクロドメインの異常に寄与している可能性があり、心房性不整脈の病態生理を理解するための新たな標的を提供する。著者らは、知見は種やモデル間で強固であるものの、これらの構造的変化の具体的な機能的影響およびミトコンドリアの挙動や細胞生存への影響を完全に解明するには、今後の研究が必要であると述べている。